Magyar Tudomány, 2004/3 306. o.

Őssejtek

Rajnavölgyi Éva

az MTA doktora, Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Általános Orvostudományi Kar Immunológiai Intézet

AZ ŐSSEJTEK ÉS AZ IMMUNRENDSZER

Bevezetés

Az őssejtek korlátlan ideig osztódó, nem specializálódott önmegújító sejtek, amelyek aszimmetrikus osztódás révén önmagukhoz hasonló sejteket és emellett elkötelezett utódsejteket hoznak létre. Az emlős egyedfejlődés korai embrionális szakaszában kialakuló embrionális őssejtek (embryonal stem - ES) a szervezet mintegy kétszáz különböző szövetének újraképzésére képesek. Ezek a sejtek ma már izolálhatók, és - ellentétben az adott funkciókra szakosodott differenciált testi sejtekkel - megfelelő in vitro körülmények között korlátlan ideig fenntarthatók vagy különböző testi sejtekké alakíthatóak.

Az embrionális és a magzati egyedfejlődést követően a felnőtt szervezet specializálódott testi sejtjei között nagyon kis számban jelen vannak olyan sejtek, amelyek megtartják önmegújító képességüket és azt a sajátságukat is, hogy belőlük többféle típusú utódsejt alakulhat ki. Mai tudásunk alapján mintegy húsz eltérő szöveti őssejttípus azonosítható, amelyek nagyfokú fejlődési rugalmassággal rendelkeznek. Ide tartoznak a csontvelői vérképző őssejtek is, amelyek a vér összes sejttípusának kialakulását biztosítják. Akár egyetlen ilyen őssejt is képes a szervezet teljes vérrendszerét felépíteni (Osawa, 1996). Emlősökben az immunrendszer működését biztosító sejtek a magzati élet utolsó szakaszától kezdve a csontvelői hematopoetikus őssejtekből (hematopoietic stem cell - HSC) fejlődnek. Ez a folyamat nem fejeződik be a születést követően, hanem egész életünket végigkíséri. A vér sejtes elemeinek folyamatos újratermelődése, gyors válasza a különböző stresszhatásokra (például vérzés, fertőzések) és az egyensúly fenntartása összetett szabályozó mechanizmusok eredménye. Az immunrendszer sejtjeinek állandó újraképződése alapvető fontosságú a szervezet megfelelő védelmét biztosító folyamatok zavartalan és hatékony lezajlásához.

Különleges regenerációs képességük és "halhatatlan" sajátságuk alapján mind az embrionális, mind a felnőtt őssejtek felhasználhatók hiányzó, károsodott vagy hibásan működő szövetek pótlására, helyettesítésére. A különböző eredetű őssejtek terápiás felhasználási lehetőségeivel ma már külön tudományág, a regenerációs medicina foglalkozik. Ennek kutatási és alkalmazási területe kiterjed az embrionális őssejtekből származó működő szövetek előállítására és megfelelő előkészítésére éppúgy, mint a szöveti őssejtek izolálására és megfelelő számban történő felszaporítására. Az őssejtek elvi felhasználási lehetőségei a gyógyításban szinte korlátlanok, de ezek nagy része jelenleg még komoly etikai és módszertani korlátokba ütközik. Továbbá az őssejtek terápiás felhasználási lehetőségeinek jelentős gátat szabnak az őssejtek és a belőlük származó szövetek korlátlan beültetését akadályozó immunológiai reakciók is. Ebben a rövid áttekintésben a HSC-knek az immunrendszer működésében betöltött létfontosságú szerepét próbálom meg érzékeltetni, valamint a különböző őssejtek sajátságainak és felhasználási lehetőségeinek néhány, az immunrendszer működésével kapcsolatos vonatkozását ragadtam ki. Bár a HSC-k a terápiás célra legrégebben alkalmazott őssejtek (Pálóczi, 2003), az ezzel kapcsolatos legújabb eredményeket és terápiás vonatkozásokat e kötet egyéb fejezetei érintik.

Az immunrendszer sejtjei a hematopoetikus őssejtek leszármazottai

A HSC-ből fejlődő sejtek általában rövid élettartamúak, és ezért folytonos utánpótlást igényelnek. A szerzett immunitás legfontosabb sejtjei a limfociták, amelyek a csontvelői HSC-ből képződő limfoid előalakokból fejlődnek (1. ábra).

A B-limfociták érése a csontvelőben zajlik, míg a T-limfocitáké és a természetes ölő sejteké (natural killer - NK) a tímuszban folytatódik (1. ábra). A HSC-kből differenciálódó mieloid előalakokból - szintén a csontvelőben - alakulnak ki a monociták, a dendritikus sejtek, a granulociták és a hízósejtek, amelyek a természetes immunitás fontos szereplői, valamint a szerzett immunitás számos folyamatában is részt vesznek (Rajnavölgyi, 2003, 1. ábra). A vérben keringő monocitákból a perifériás szövetekben differenciálódó makrofágok és dendritikus sejtek hivatásos antigénbemutató sejtek, és ezáltal a T-sejtek által közvetített sejtes immunválasz fontos szabályozói. A makrofágok, a szöveti hízósejtek és a granulociták a természetes immunitás hatékony effektor sejtjeiként működnek, és elősegítik a szerzett immunitás hatékony működését is (Erdei, 2003).

A limfociták élettartama, osztódása, öregedése

A felnőtt emberi szervezetben a limfociták száma megközelítőleg 1012, a B- és T-limfociták megoszlása közel azonos. A limfocitákra jellemző, hogy egyedileg eltérő antigén-felismerő receptorokkal rendelkeznek, és ezáltal nagyszámú, eltérő szerkezetű antigén felismerésére képesek. Az egyes limfociták az antigén ingertől függően eltérő időpontokban aktiválódnak és indulnak osztódásnak. A limfociták egyik legfontosabb sajátsága az antigén hatására bekövetkező gyors klonális osztódás, ami időlegesen biztosítja a megfelelő specificitással rendelkező sejtek feldúsulását és az adott antigénnel szembeni hatékony védelmet (2. ábra).

Az antigén eltávolítását követően azonban a felszaporodott sejtek feleslegessé válnak, elpusztulnak, és az egyensúly fenntartása érdekében a csontvelőből új sejtek pótolják őket. A naiv, antigénnel még nem találkozott limfociták folyamatos újraképződése a HSC-kből biztosítja a rendelkezésre álló limfocitakészlet terjedelmét, egyensúlyát és az immunrendszer állandó felkészültségét az újabb és újabb környezeti hatásokkal szemben.

Az immunrendszer hatékony működése szempontjából fontos kérdés, hogy mennyi ideig élnek és hányszor képesek a limfociták az antigén-specifikus aktiváció hatására osztódni. A sejtbiológiai kutatások még az 1960-as évek elején igazolták, hogy a testi sejtek csak bizonyos ideig képesek szaporodni. Ezek a vizsgálatok azt is felderítették, hogy a sejtek megkétszereződésének lehetőségeit nem az időtartam, hanem az osztódások száma határozza meg. Ezt a jelenséget "osztódási öregedésnek" nevezték, amely tulajdonság függ a fajtól, az egyed korától és genetikai adottságaitól. Így például a rövid életű élőlények sejtjei kevesebb osztódásra képesek, mint a tovább élő fajoké, a magzati vagy az újszülöttekből származó sejteknek több osztódási lehetőségük van, mint az idősebbek sejtjeinek. Kísérletes adatok azt is alátámasztották, hogy a korlátozott idejű szaporodó képesség domináns genetikai sajátosság, és a törzsfejlődés során valószínűleg a korlátlanul szaporodó sejtek (például rosszindulatú daganatok) kialakulását gátló fontos mechanizmus. A sejtosztódások számát a sejtekben "biológiai órák" szabályozzák, amelyek meghatározott gének aktivációja és kiiktatása révén "számolják" az adott sejt osztódási lehetőségeinek számát. Egy ilyen fontos időmérő mechanizmust az ún. telomérák biztosítanak. Ezek az ismétlődő DNS-szekvenciák a magvas sejtek kromoszómavégeit védik az enzimatikus hasítástól, és ezáltal fokozzák azok genetikai stabilitását. A telomérák azonban minden sejtosztódás során rövidülnek, és egy kritikus hossz elérésekor a sejt osztódóképességének leállítását eredményezik. A telomérák rövidülését bizonyos sejtekben, így például az őssejtekben és a legtöbb rosszindulatú daganatos sejtben, a telomérák helyreállítását biztosító telomeráz enzim komplex ellensúlyozza.

A B- és T-limfocitákban a telomeráz enzim aktivitása függ a sejt altípusától, fejlődési és aktivációs állapotától. Így például a tímuszban és a perifériás T-limfocitákban a telomeráz aktivitás - a rosszindulatú tumorsejtekhez hasonlóan - magas, de mintegy tíz osztódási ciklust követően jelentősen csökken. A B-limfociták összes osztódásainak száma sejtkultúrában átlagosan huszonhárom, míg a T-limfociták esetében mintegy harmincötre becsülhető. Így egyetlen T-limfocita egész élete során mintegy 1010 utódsejtet képes létrehozni, ami jól érzékelteti az adott antigén specificitással rendelkező limfocita klónok funkcionális hatékonyságát. Az egyes T-sejt klónok osztódása azonban - az immunrendszer működési elve alapján - megszakításokkal, hullámokban történik, amelyeket a felesleges sejtek pusztulása követ. A 2. ábra a T-limfociták ismétlődő antigén ingerre bekövetkező osztódási szakaszait vázolja fel. Ennek alapján érthető, hogy a sokszor ismétlődő vagy folytonos antigén stimuláció az egyes T-sejt klónok "kimerülését" váltja ki, amit a megváltozott működéssel járó öregedés, majd sejthalál követ. A folyamat során képződő kevés, lassan osztódó memóriasejt ezzel szemben mintegy kettő-öt évig is életben maradhat, és hosszú ideig képes az immunológiai memória fenntartására.

Az osztódások számával öregedő limfociták nem válnak teljesen funkcióképtelenné, de az osztódóképesség leállását fontos, az immunológiai funkciókat befolyásoló genetikai és fenotípusváltozások kísérik. Így például csökken az antigén ingerre történő aktiváció mértéke és a programozott sejthalállal (apoptózissal) szembeni érzékenység. Ilyen elöregedő, nem funkcióképes T-limfociták szaporodnak fel - az egyed korától függetlenül - a krónikus antigén stimulációval járó betegségben, így például a humán immundeficiencia vírussal (HIV) fertőzött egyedek perifériás vérében is.

Az immunrendszer differenciált sejtjei tehát folyamatosan öregednek, a tímusz serdülőkorban történő visszafejlődésével pedig csökken az újonnan képződő T-limfociták száma is. Ennek következtében a perifériás nyirokszövetekben és a vérben nő a memóriasejtek aránya, ami a szervezet "immunológiai tapasztalatait" felhasználva védelmet biztosít számos antigénnel szemben. Az immunrendszer rugalmassága az ismétlődő stresszhatások, új kórokozók vagy a daganatos sejtek szaporodásának kivédésében azonban egy idő után csökken. Ezért fontos immunológiai és talán gerontológiai kérdés is, hogy mennyire változik meg az immunrendszer folyamatos utánpótlását biztosító HSC-k funkciója a kor előrehaladtával, hiszen ez az egész szervezet élettartamát is befolyásolhatja. Öregszenek-e az őssejtek?

A limfocitákkal ellentétben a csontvelői sejtek csupán 0,01 %-át kitevő HSC-k hosszú életűek, az "örök életet" a telomérák rövidülését helyreállító telomeráz enzim mellett egyéb mechanizmusok is biztosítják. Ennek egyik bizonyítéka, hogy a HSC-k és a belőlük származó, eltérő funkciójú utódsejtek száma az öregedéssel nem csökken, sőt bizonyos beltenyésztett egértörzsekben növekedik. Ennek ellenére kísérleti adatok igazolták, hogy a vérképző rendszer pótlásához az idős HSC-kből többre van szükség, mint a fiatalokból. Ez arra utal, hogy a HSC-k száma ugyan nem, de funkcionális aktivitása a kor előrehaladtával csökken.

Ellentétben az embrionális őssejtekkel, az emberi HSC-kben kimutatható a telomérák hosszának rövidülése és ezáltal az osztódással járó öregedés is, noha ezt a magas telomeráz aktivitás részben ellensúlyozza. Emellett azonban a HSC-k korral járó funkcionális módosulását egyéb belső tényezők vagy külső hatások, mint például a sztrómasejtek öregedése, funkcionális változásai is előidézhetik. A HSC-k jellegzetes nem differenciált állapota és a limfoid leszármazottak fokozott érzékenysége a radioaktív sugárzással szemben arra utal, hogy az öregedő HSC-kben zajló belső változásokat - más sejtektől eltérően - elsősorban a genomiális DNS-ben halmozódó mutációk, az ezeket helyreállító mechanizmusok károsodása és a sejtciklus szabályozásának zavarai idézik elő. Ezzel szemben a csontvelő és a tímusz eltérő sztrómasejtjeinek (például a fibroblasztok, hámsejtek) öregedéssel járó változásai hasonlóak az egyéb testi sejtek öregedését előidéző folyamatokhoz, amiben a fenti mechanizmusok mellett fontos szerepet játszanak az oxidatív stressz által kiváltott fehérje- és lipidváltozások is. Ezek az eltérések a HSC-k fejlődését biztosító speciális környezetben (csontvelő, tímusz) a citokinek koncentrációjának, összetételének, a lebontó enzimek és a sejten kívüli mátrix fehérjék mennyiségének, szerkezetének és funkcióinak módosulásához vezethetnek. Ezek a külső tényezők szintén jelentősen befolyásolhatják a HSC-k regenerációs képességét (Effros, 1997). Ez a folyamat megy végbe a tímusz serdülőkorban bekövetkező visszafejlődésekor, amikor a megváltozott sztróma gátolja a csontvelői timocita előalakok bevándorlását és ezt követő differenciálódását, noha a T-sejt előalakok száma nem változik. Ebben a folyamatban fontos szerepet játszik a tímusz hámsejtek által termelt IL-7 citokin termelésének csökkenése, ami hátráltatja a timociták osztódását és túlélését.

Hosszú és rövid életidejű HSC-kkel jellemezhető beltenyésztett egereken végzett genetikai vizsgálatok igazolták, hogy a 2., a 7. és a 11. kromoszómán azonosított, az állatok korának szabályozásához kapcsolható hét különböző gén lókusz közül öt a HSC-k életidejét is befolyásolta. Érdekes módon ezekben a kromoszómarégiókban a sejtciklus szabályozásában és a DNS-helyreállításban szereplő géneket is azonosítottak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bár a HSC-k egészséges egyedekben az egész élet során gondoskodnak a vérsejtek számának folyamatos fenntartásáról, "funkcionális" életidejük közvetlenül vagy közvetve hatással van az egész szervezet élettartamára.

Noha a HSC-ket érintik az öregedés bizonyos tünetei, önmegújító és sokféle utódsejtet létrehozó képességük hosszú ideig lehetővé teszi a teljes vérképző rendszer, ezen belül az immunrendszer sejtjeinek folytonos újraképzését. Ahogy ezt a csontvelőátültetések gyakorlata igazolja, a felnőttkori HSC-k képesek a teljes vérképző rendszer és az immunrendszer regenerációjára. Az utóbbi néhány év vizsgálatai továbbá azt is igazolták, hogy a HSC-k és leszármazottaik nagyobb rugalmassággal rendelkeznek, mint azt előzetesen gondolták. Így a HSC-k más szöveti környezetbe helyezve egyéb szöveti sejtekké is fejlődhetnek, valamint a csontvelőben a HSC-knél szélesebb regenerációs képességgel rendelkező őssejtek is találhatók (Jiang, 2002).

Az őssejtek terápiás alkalmazásának immunológiai korlátai

Az immunrendszer egyik fontos biológiai funkciója a szervezet integritásának, belső egyensúlyának folyamatos védelme. Ennek érdekében az immunrendszer felismeri és tolerálja a saját szerveket, szöveteket, de sejtpusztító folyamatokkal lép fel a testidegen kórokozók, valamint a más egyedből származó idegen szövetek ellen. Az emberi populáció immunológiai szempontból rendkívül sokféle, ami jelentős előny a faj megmaradása szempontjából, de nem kedvez a szervátültetésnek, hiszen az emberi szövetek másik egyedbe juttatva erős immunológiai, ún. szövet kilökődési reakciót váltanak ki. Bár szervezetünk zömében hasonló fehérjékből épül fel, a kilökődési reakció során a befogadó szervezet immunrendszere idegenként ismeri fel a beültetett szövet eltérő, polimorf fehérjéit. Ilyen reakciót váltanak ki például a vércsoport antigének, valamint a T-limfociták antigénfelismerő működését szabályozó fő szövet összeférhetőségi génkomplex (major histocompatibility gene complex - MHC) génjei által kódolt membránfehérjék (Gogolák et al., 2003). Az MHC molekulák az emberi genom legváltozatosabb fehérjéi, amelyek két egyed között csak az egypetéjű ikrekben azonosak, közeli rokonokban lehetnek részben azonosak, de nem rokon egyedek között nagy valószínűséggel eltérőek. Így a kilökődési reakció csak a saját őssejtek vagy a saját őssejtekből származó szövetek visszaültetésekor (autológ szövetátültetés) kerülhető el. Az emberi felnőtt csontvelőből és a köldökzsinórvérből kis számban izolálható HSC-k az autológ szövetátültetés lehetőségét nyújtják. Más, genetikailag eltérő egyedek szöveteinek bejuttatásakor (allogén szövetátültetés) az immunrendszer reakciói komoly gátat jelentenek az őssejtek vagy a belőlük származó szerv megtapadásának.

A szövetkilökődési reakció erőssége függ a beültetett sejt vagy szövet, a "graft" és a befogadó szervezet, a "recipiens" közötti genetikai eltérések mértékétől, valamint az adott szövet egyedi sajátságaitól, elsősorban immunogenitásától. Az immunogenitást a szöveti összeférhetőséget meghatározó MHC fehérjék szerkezete és kifejeződésének mértéke mellett az adott szövetben jelen lévő, donor eredetű hivatásos antigént bemutató sejtek (dendritikus sejtek, makrofágok) száma határozza meg.

Az őssejtek és az őssejt eredetű szövetek immunogenitása

Az eltérő donorokból előállított ES-sejtek, valamint az ezekből előállított különböző szövetek - a felnőtt testi sejtekhez és szövetekhez hasonlóan - immunológiai szempontból rendkívül sokfélék. Így az őssejtek és a belőlük származó szövetek nem rokon egyedbe juttatva kilökődési reakciót válthatnak ki. Az emberi ES-sejteken - mint minden testi sejten - megjelennek az I típusú MHC molekulák, de csak nagyon kis számban. A szöveti differenciálódás során sejtfelszíni megjelenésük fokozódik, de az érett testi sejtekhez viszonyítva alacsony marad. Az ES-sejtek II típusú MHC molekulákat nem fejeznek ki, azonban rendelkeznek IFNg receptorral és az IFNg citokin hatására fokozódik az MHC molekulák kifejeződése. Bár az ES-sejtek és a belőlük származó szövetek immunogenitása az MHC molekulák alacsony szintje miatt kisebb, mint a felnőtt szöveti sejteké, allogén egyedbe ültetve kilökődési reakciót válthatnak ki. Az emberi szövetek és az ES eredetű szövetek közötti legfontosabb immungenitási eltérés azonban abból adódik, hogy az utóbbiak nem tartalmaznak szöveti dendritikus sejteket. A csontvelőátültetések gyakorlatából ismert, hogy a szöveti dendritikus sejtek kiemelt szerepet játszanak az allo-graftok immunogenitásának fokozásában, mivel nagy számban hordoznak MHC molekulákat (direkt bemutatás), valamint hatékonyan mutatják be a graft polimorf fehérjéiből származó peptideket a befogadó szervezet T-limfocitái számára (3. ábra, Rajnavölgyi, 2003).

A graft eredetű dendritikus sejtek hiánya az ES eredetű szövetekben jelentősen csökkenti az immunogenitást és az akut kilökődési reakció mértékét. A befogadó szervezet saját hivatásos antigént bemutató sejtjei (makrofágok, dendritikus sejtek) azonban felvehetik az elöregedő vagy elpusztult donor sejteket vagy az azokból felszabaduló szöveti antigéneket, és a T-limfociták számára "indirekt" módon bemutatják a donor eredetű fehérjékből származó peptideket (3. ábra). Az antigénbemutatásnak ez a módja is képes aktiválni az allo-reaktív T-limfocitákat és kiváltani a kilökődési reakciót.

Az immunológiai korlátok csökkentésének lehetőségei

1. Az őssejtek és az őssejt eredetű szövetek módosítása

A felnőtt szövetekhez hasonlóan az immunológiai korlátok csökkentésének egyik lehetősége a donor és a befogadó szervezet szövetei közötti genetikai különbségek csökkentése. Ezt szolgálja az "őssejtbankok" létrehozása, ami lehetővé teszi nagyszámú, ismert MHC molekulákat kifejező őssejtek hosszú távú tárolását, és ezt követően az egymásnak legjobban megfelelő donorok és recipiensek kiválasztását.

Ellentétben a felnőtt szövetek felhasználásával végzett terápiás eljárásokkal, az őssejtek felhasználása során további manipulációs lehetőségek is elősegíthetik az immunológiai összeférhetetlenség kiküszöbölését (Bradley, 2002). A "genomikai helyettesítés" módszere sikeresen alkalmazható eljárás arra, hogy az ES-sejtből származó szövetet immunológiailag elfogadhatóvá tegyük a kiválasztott donor számára a laboratóriumi és háziállatokban. A "sejtmagátvitel" vagy "terápiás klónozás" néven is ismertté vált eljárás során a befogadó szervezetből származó érett petesejtből eltávolítják a genetikai állományt, majd azt a donor testi (szomatikus) sejtjeiből származó genommal helyettesítik. Így az osztódó embrionális őssejtekből in vitro létrehozott szövetek genetikai állománya - a mitokondriális gének által kódolt ún. "minor" szövet összeférhetőségi fehérjéket kódoló gének kivételével - megegyezik a befogadó szervezet génjeivel. Az eljárás rendkívül idő- és költségigényes, ezért a jövőben csak úgy válhat terápiás célra is alkalmazható eljárássá, ha a szomatikus géntranszfer segítségével ismert genotípusú ES-sejtvonalbankokat hoznak létre, amelyek lehetőséget adnak a donor genotípusával azonos ES-sejtek kiválasztására. Ez a lehetőség jelenleg nemcsak etikai, de módszertani nehézségek miatt sem alkalmazható emberben, mivel a géntranszferrel módosított emberi petesejtek osztódó képessége lényegesen rosszabb, mint az eddig alkalmazott, nem a főemlősökhöz tartozó fajokban.

Az őssejtek genetikai módosításával olyan univerzális donorsejtek is létrehozhatók, amelyek a genetikai háttértől függetlenül is felhasználhatók. A donor szöveti sejtjein megjelenő MHC molekulák kiemelt szerepet játszanak a szövetkilökődés elindításában, így az MHC gének eltávolítása vagy inaktiválása olyan sejteket eredményezhet, amelyek a donor T-limfocitái számára nem felismerhetők. Ez a beavatkozás azonban jelentősen növeli a sejtek érzékenységét a természetes ölősejtek (NK sejtek) funkcióival szemben, ami jelentős szövetkárosodást eredményezhet. Ennek a stratégiának a legnagyobb kockázata azonban az, hogy az MHC molekulák hiányában a bevitt szövet kikerül az immunrendszer ellenőrző funkciója alól. Így az ilyen szöveti sejtek alkalmasak lehetnek például különböző vírusok hosszú távú "bujtatására" vagy tumorok kialakítására is, hiszen a vírus vagy tumor antigénekből származó peptidek az MHC molekulák hiányában nem kerülhetnek bemutatásra, és így ezek a sejtek észrevétlenek maradnak a T-limfociták és a sejtes immunitás számára. Ezt a lehetőséget támasztják alá azok a megfigyelések, miszerint a legagresszívebb rosszindulatú daganatok és a legsikeresebb patogén vírusok olyan menekülési mechanizmusokat fejlesztettek ki, amelyek az MHC molekulák megjelenését képesek gátolni.

2. A kilökődési reakció gátlása

A donorszövet kilökődése az immunrendszer működését gátló szerekkel is megakadályozható. Ezek az eljárások hasonlóak az allogén csontvelő-átültetés során alkalmazott terápiás lehetőségekhez. Az immunrendszer folyamatainak gátlása azonban nemcsak a kilökődési reakciót, de az immunrendszer általános védelmi funkcióit is gátolja, és egyéb súlyos mellékhatásokkal is jár.

Az ES-sejtek vagy az ES-sejt eredetű szövetek túlélése olyan módon is biztosítható, hogy azokat az immunrendszer működését gátló génekkel vértezzük fel. Így a programozott sejthalált (apoptózist) kiváltó receptorokhoz kötődni képes Fas ligand bevitele a befogadó szervezet graft-specifikus T-sejtjeinek pusztulását eredményezheti. A T-sejtes immunitást gátló IL-10 citokin génjének bevitelével az ES eredetű szövetet védő környezet alakítható ki.

A szervkilökődési reakció gátlásának ígéretes lehetősége a donorszövetre specifikus aktív immunológiai tolerancia kiváltása. Az eljárás előnye, hogy a donorszövet ellen kialakított specifikus immunológiai válaszképtelenség nem érinti az immunrendszer egyéb, a szervezet számára fontos funkcióit. A donorszövet beadásának megfelelő módja és időzítése elősegítheti a tolerancia kialakulását és a kilökődési reakció gátlását. A donor eredetű vér transzfúziója a beültetést megelőzően, a transzplantátum környezetébe bejuttatott donor eredetű limfociták, a donorsejtek tímuszba történő oltása, valamint a hematopoetikus kimerizmus kiváltása rágcsálókban végzett modellkísérletekben alkalmasnak bizonyult a donorsejtek elleni tolerancia kialakítására. A tolerancia kiváltását segítheti a citokin egyensúly irányított megváltoztatása vagy a dendritikus sejtek és a T-limfociták közötti kapcsolatok gátlása is. A befogadó szervezet dendritikus sejtjei továbbá in vitro körülmények között oly módon is előkezelhetők a donor allo-antigénjeivel, hogy azok a visszaadást követően a befogadó szervezet válaszképtelenségét váltsák ki. Ezek a még kísérleti fázisban lévő lehetőségek csupán rövid ideig tartó kezelést igényelnek, de feltehetőleg speciális szabályozó T-limfociták aktiválása révén hosszú távú tolerancia kialakulásához vezethetnek.

A "kevert hematopoetikus kiméra állapot" kialakítása a felnőtt szövetek beültetése során az egyik leghatékonyabb módja a tolerancia kiváltásának. Ezt az állapotot allogén donor eredetű HSC-k beültetésével lehet elérni, ami a donor és a gazdaszervezet hematopoetikus sejtjeinek hosszú távú együttes jelenlétét eredményezi. Az ilyen kiméra szervezetekben a donor eredetű szövetek allo-antigénjeivel szemben tolerancia alakul ki, és a testi sejtek beültetését követően a kilökődési reakció nem következik be. A kiméra állapot nemcsak HSC-kkel, de az MHC génekben eltérő ES-eredetű hematopoetikus sejtekkel is kiváltható. Patkányokban végzett kísérletekkel igazolták, hogy az ES-szerű sejtvonalak vérkeringésbe juttatása stabil kevert kiméra állapotot eredményezett (Fandrich, 2002). A bejuttatott donor eredetű ES-sejtek betelepítették a tímuszt, és ezáltal a T-limfociták érése során a donorszövet allo-antigénjeit felismerő sejtek a negatív szelekciós folyamat eredményeként elpusztultak, és nem kerültek ki a perifériás nyirokszervekbe. Az így felkészített gazdaszervezet - saját szöveteihez hasonlóan - elfogadta a később beültetett donorszívet (4. ábra).

Ellentétben a felnőtt csontvelői sejtekkel, amelyek érett T-limfocitákat is tartalmaznak, az ES-eredetű donorsejtek sem fordultak a gazdaszervezet szövetei ellen. Ezek az eredmények azt igazolják, hogy az allogén ES-eredetű sejteket az immunológiailag kompetens felnőtt szervezet kilökődési reakció nélkül képes elfogadni, és ezáltal a szervezet - az immunrendszert károsító előkezelés nélkül - felkészíthető a donorszövet (például hasnyálmirigysejtek, szívizomsejtek) befogadására. Az ES-sejtek - a teratoma-képződés veszélye miatt - önmagukban erre a célra nem használhatók fel. Új kísérletek azonban igazolták, hogy az ES-sejtekből in vitro hematopoetikus őssejtek állíthatók elő (Kaufman, 2001), amelyek kísérleti állatokban biztosítják a hematopoetikus sejtek fejlődését (Kyba, 2002).

Az őssejtek előnyös immunológiai sajátságai a génterápia során

Ahogy az előzőek is igazolták, az immunrendszer egyik fontos sajátsága, hogy képes különbséget tenni a saját és a nem saját szövetek között. A kérdés természetesen az, hogy a felnőtt immunrendszer számára mi tekinthető sajátnak. Számos példa igazolja, hogy a "genetikai saját" nem jelenti azt, hogy az immunrendszer a szervezet összes komponensét sajátnak tekinti. Az "immunológiai saját" egyik lehetséges meghatározása, hogy az immunrendszer azokat a szöveti fehérjéket tekinti sajátnak, amelyekkel az egyedfejlődés korai szakaszában találkozott, és velük szemben tolerancia alakult ki. Így fiziológiás körülmények között az őssejteknek és a belőlük kialakuló differenciált, adott funkcióra specializálódott sejteknek fontos szerepük van az immunológiai saját és az immunológiai tolerancia kialakításában.

Ez azt is jelenti, hogy az egyetlen gén hibájából származó kóros elváltozások terápiás korrigálása során a testi sejtekbe mesterségesen bevitt gén fehérjeterméke "idegennek" minősül a szervezet számára, és ezért az immunrendszer az adott gént hordozó sejtekkel szemben kilökődési reakcióval válaszol. Ez az immunológiai reakció a génterápiás eljárások kudarcát jelentheti, amit számos megfigyelés igazol. Az is bizonyítást nyert, hogy a génbevitellel módosított differenciált szöveti sejtekben az immunrendszer először a gén bevitelét szolgáló - általában vírus eredetű - vektort ismeri fel, majd ezt követően fordul a bevitt gén fehérjeterméke ellen. Az immunrendszer reakcióját tehát nemcsak az "idegenként" felismert géntermék váltja ki, hanem a vektor. A DNS, illetve a bevitel hatására kialakuló helyi gyulladási reakció "veszély"-jelként is hat, és elősegíti az immunológiai folyamatok beindulását (Brown, 2002). Ennek hátterében az áll, hogy a vektor aktiválja a természetes immunitás elemeit, például a természetes ölősejteket, amelyek a vektort hordozó sejteket elpusztítják. A károsodott sejteket, valamint a belőlük kiszabaduló fehérjéket - köztük a bevitt gén termékét - a szöveti dendritikus sejtek felveszik, és hatékonyan mutatják be a T limfociták számára (3. ábra). Ennek következtében a vektort és ezzel együtt a korrekciós gént hordozó sejtek a citotoxikus T-limfociták (Tc) és az immunválasz egyéb effektor funkcióinak áldozatává válnak.

Ennek a mechanizmusnak az alapján a génterápiás eljárások hatásfoka a "veszély"-jelek csökkentésével és/vagy megszüntetésével jelentősen javítható. Ennek egyik lehetősége a kevéssé immunogén vektorok kifejlesztése, valamint a legalkalmasabb hordozó sejtek kiválasztása. In vitro állatkísérletekben igazolták, hogy ha a specializálódott limfociták helyett a helyettesítendő gént autológ hematopoetikus őssejtekbe juttatták be, akkor az adott génnel transzfektált HSC-k nem kilökődési reakciót, hanem hosszan tartó toleranciát váltottak ki. Ahogy korábban már említettük, a HSC-k a befogadó szervezetben különböző vérsejtekké, többek között makrofágokká és dendritikus sejtekké differenciálódnak. Az így képződő antigén bemutató sejtek fiziológiás körülmények között az új fehérjét sajátként mutatják be a tímuszban, és ezáltal hosszan tartó immunológiai toleranciát váltanak ki (3. ábra). Ennek alapján a HSC-k a génterápia új, ígéretes eszközei lehetnek, és felhasználhatók a befogadó szervezet megfelelő immunológiai előkészítésére, a specifikus immunológiai tolerancia kialakítására.

Saját kutatások

A T-limfociták különböző altípusai által közvetített sejtes immunválasz szinte minden típusú patogén elleni hatékony védekezés fontos eleme, alapvető szerepet játszik az allergiás reakciók kialakulásában, a daganatok elleni immunológiai folyamatokban és a saját szövetekkel szembeni immunológiai tolerancia létrehozásában, fenntartásában is. A T-limfociták a szerzett immunitás antigént felismerő és végrehajtó sejtjei, működésükhöz azonban a természetes immunitáshoz tartozó antigént bemutató sejtekre, például dendritikus sejtekre van szükség. A T-limfocitáknak számos, funkcionálisan eltérő altípusa ismert: a CD4+ segítő és a CD8+ sejtölő képességgel rendelkező T-limfociták mellett az ún. szabályozó sejtek - amelyek az immunválasz mértékét és lefolyását irányítják - szintén ide sorolhatók. Eltérő funkcióik ellátásához a T-limfociták átmeneti kapcsolatokat teremtenek a dendritikus sejtekkel, a két sejt kölcsönhatása kétirányú szabályozást tesz lehetővé, amely meghatározza a celluláris immunválasz mértékét, irányultságát, összetevőit (Rajnavölgyi - Lányi, 2003). Mind a dendritikus sejtek, mind a T-limfociták funkcionális szempontból rugalmas sejtek, így az antigén természetétől, a szervezetet ért "veszély"-jelektől függően többféle módon képesek válaszolni az őket ért hatásokra. A dendritikus sejtek közé többféle sejtféleség sorolható, amelyek a HSC-kből és más előalakokból is előállíthatók. A dendritikus sejtek izolálására és in vitro fenntartására, differenciáltatására kidolgozott új eljárások lehetőséget adnak arra, hogy a dendritikus sejtek funkcióit in vitro módosítsuk, és segítségükkel a sejtes immunválasz hatásfokát, irányát befolyásoljuk. Saját vizsgálatainkban elsősorban a dendritikus sejtek és a CD4+ T-limfociták kölcsönhatását vizsgáljuk azzal a céllal, hogy a vírus- és a tumorellenes immunitás hatékonyságát növeljük (Gogolák, 2003). Továbbá olyan módszerek kifejlesztésén is dolgozunk, amelyek segítségével az immunológiai tolerancia a dendritikus sejtek in vitro előkészítése révén kiváltható, erősíthető.

Kulcsszavak: embrionális őssejt, hematopoetikus őssejt, szövetkilökődés, antigén bemutatás, dendritikus sejt, T-limfocita, klonális osztódás, regenerációs medicina

1. ábra * Az immunrendszer működésében részt vevő sejtek fejlődése a hematopoetikus őssejtekből - A hemopoetikus őssejtekből a csontvelőben mieloid és limfoid előalakok képződnek. A mieloid sejtek leszármazottai specializált sejtekké érnek és a vérkeringésbe kerülnek. A vérben keringő dendritikus sejtek, monociták és granulociták megfelelő ingerek hatására átlépnek az érfalon, és utódaik a testi szövetekben telepednek le. A limfoid előalakokból a csontvelőben fejlődnek a B-limfociták, míg a T-limfociták és a természetes ölősejtek előalakjai a csontvelőből a tímuszba vándorolnak, és differenciálódásuk ott fejeződik be. A B- és T-limfociták a vér- és a nyirokkeringés révén örökös körforgásban vannak, antigén-specifikus aktivációjuk a perifériás nyirokszervekben történik.

2. ábra * A T-limfociták osztódási szakaszainak vázlatos menete - Az antigén-specifikus T-limfociták az elsődleges antigén inger hatására gyors osztódásnak indulnak, aminek eredményeként időlegesen nagymértékben megnő a kiválasztott sejtek aránya. Az antigén sikeres eltávolítását követően - további antigén inger hiányában - a feleslegessé vált T-limfociták programozott sejthalál révén elpusztulnak, csupán néhány memóriasejt marad életben. A memóriasejtek az antigén ismételt belépésekor gyorsan újra osztódnak, az összes lehetséges osztódást követően azonban funkcionálisan kimerülnek. Ha a memóriasejtek újbóli aktivációja nem következik be, azok lassú osztódással tartósan fennmaradnak, miközben lassan öregszenek (Effros - Pawelec nyomán).

3. ábra * Az allo-graft és a génkorrekcióval módosított sejtek elleni kilökődési reakcióban szerepet játszó immunológiai folyamatok - Az allogén testi sejtek beültetésekor a graft testidegen MHC-I molekulákat fejez ki, amit a befogadó szervezet T-limfocitái felismernek. A II típusú MHC és a ko-stimulációs molekulák hiányában ez a folyamat nem indítja el a kilökődési reakciót. A beültetett graft szöveti vagy a vérárammal bekerülő dendritikus sejtjei azonban nagy számban fejezik ki az I és II típusú MHC, valamint a kostimuláló molekulákat is, és hatékonyan indítják el a befogadó szervezet allo-reaktív T-limfocitáinak aktiválódását. Az allo-antigének bemutatásában a befogadó szervezet saját dendritikus sejtjei úgy vesznek részt, hogy felveszik az allo-graft elhaló sejtjeit vagy a belőlük felszabaduló allo-antigéneket, majd a feldolgozott fehérjék peptidjeit bemutatják a T-limfociták számára. Ebben a folyamatban a segítő Th- és a sejtölő képességgel rendelkező Tc-limfociták együttműködve vesznek részt. A génkorrekciós terápia során az "új fehérje" hasonló mechanizmus révén fordíthatja maga ellen az immunválaszt. Ezt a folyamatot a természetes immunitást - köztük a dendritikus sejteket - aktiváló "veszélyjelek" nagymértékben elősegítik.

4. ábra * A kevert kiméra állapot szerepe a tolerancia kialakításában - A "kevert hematopoetikus kiméra" állapot kialakulását követően a tímuszt mind az allogén donor (D), mind a befogadó szervezet, a recipiens (R) saját dendritikus sejtjei telepítik be. A donor és a recipiens eredetű csontvelői T-limfocita előalakok közül mindazok, amelyek a kétféle eredetű dendritikus sejt által bemutatott fehérjék peptidjeit felismerik, így az allo-reaktív T-limfociták is (A) a tímuszban zajló negatív szelekciós lépések eredményeként programozott sejthalállal elpusztulnak (deléció). Így a perifériás nyirokszervekbe és a keringésbe nem kerülnek ki autoreaktív T-limfociták, ezáltal az ugyanabból a donorból származó szöveti sejtek allo-antigénjeivel szemben a befogadó szervezetben hosszú távú tolerancia alakul ki (Bradley et al. alapján).

Irodalom

Bradley, J. Andrew - Bolton, Eleanor M. - Pedersen, Roger A. (2002): Stem Cell Medicine Encounters the Immune System. Nature Reviews. Immunology. 2, 859-871

Brown, Brian D. - Lillicrap, David (2002): Dangerous Liaisons: the Role of “Danger" Signals in the Immune Response to Gene Therapy. Blood. 100, 1133-1140

Effros, Rita B. - Pawalec, Graham (1997): Replicative Senescence of T Cells: Does the Hayflick Limit Lead to Immune Exhaustion? Immunology Today. 18, 450-454

Erdei Anna (2003): A természetes immunitás hatalma. Magyar Tudomány. 48, 422-430

Fandrich, Fred et al. (2002): Preimplantation-Stage Stem Cells Induce Long-Term Allogeneic Graft Acceptance Without Supplementary Host Conditioning. Nature Medicine. 8, 171-178

Geiger, Hartmut - Van Zant, Gary (2002: The Aging of Lympho-Hematopoietic Stem Cells. Nature Immunology. 3, 329-333

Gogolák Péter - Réthi B. - Hajas G. - Rajnavölgyi É. (2003: Targeting Dendritic Cells for Priming Cellular Immune Responses. Journal of Molecular Recognition. (In Press)

Jiang, Yuehua - Jahagirdar, B. N. - Reinhardt, R. L. - Schwartz, R. E. et al. (2002): Pluripotency of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adult Marrow. Nature. 418, 41-49

Kaufman, Dan S. - Hanson, E. T. - Lewis, R. L. - Auerbach, R. - Thomson, J. A. (2001): Hematopoietic Colony-Forming Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 98, 10716-10721

Kyba, Michael - Perlingeiro, Rita C. - Daley, George O. (2002): Hoxb4 Confers Definite Lymphoid-Myeloid Engraftment Potential on Embryonic Stem Cell and Yolk Sac Hematopoietic Progenitors. Cell. 109, 20-37

Osawa, Mitsujiro - Hamad, K. - Hamada, H. - Nakauchi, H. (1996): Long-Term Lymphohematopoietic Reconstitution by a Single CD34-Low/Negative Hematopoietic Stem Cell. Science. 273, 242-245

Pálóczi Katalin (2003): Az immunrendszer újrafejlődése csontvelő-átültetést követően: az allogén őssejtterápia immunológiai vonatkozásai. Magyar Tudomány. 48, 477-487

Rajnavölgyi Éva - Lányi Árpád (2003): CD4+ T Lymphocytes in Anti-Tumor Immunity. Advances in Cancer Research. 87, 195-249

Rajnavölgyi Éva (2003): A dendritikus sejtek és terápiás felhasználási lehetőségeik. Magyar Tudomány. 48, 440-450