Bevezetés
Az őssejt-biológia az utóbbi évtizedben jól elkülöníthető, önálló tudományággá fejlődött, kialakítva sajátságos problémakörét, kísérleti stratégiáit és biológiai modelljeit. Az alapkutatásban az őssejtek új eszközt biztosítanak a különböző sejt- és szövettípusok differenciálódási folyamatainak teljesebb megértéséhez. A klinikumban még inkább forradalmi hatás várható: a különböző típusú őssejtek és progenitor sejtek felhasználásával lehetőség nyílik sérült, elhasznált vagy megbetegedett sejtek és szövetek pótlására. A klinikai alkalmazás egyre inkább reális lehetőségnek tűnik: a közeli jövőben egy alapjaiban új terápiás megközelítés, a regenerációs orvoslás korai eredményei várhatók.
Klinikus és alapkutató ugyanakkor egyaránt felteszi a kérdést: reálisak-e az elvárások a várható eredményeket illetően? Mennyiben bízhatunk a laboratóriumi eredmények gyors klinikai átfordulásában? Az őssejt-biológiához kapcsolódó etikai, helyenként politikai viták során egyes kutatók, érdekcsoportok és gyakran politikusok hajlamosak eltúlozni a várható hatást, és alábecsülik a kiterjedt klinikai alkalmazás bevezetéséhez szükséges időt. Többen felhívták a figyelmet a korai génterápiás próbálkozások kiábrándító tapasztalataira: az 1980-as években megkezdett klinikai próbálkozások mögött nem álltak valóban meggyőző, releváns állatmodellekből nyert adatok, és ez sok vonatkozásban magyarázza a primitív retrovírus vektorok kezdeti sikertelenségét. Ennek következtében csökkent mind a tudományos, mind a gyógyszergyári érdeklődés, és a korábbinál is nehézkesebbé váltak az alkalmazást szabályozó mechanizmusok és rendelkezések. Értékelhető génterápiás eredményeket csak mostanában, a korai próbálkozások után több mint tíz évvel látunk (Hacein-Bey-Abina et al., 2002). Amennyiben az őssejtkezeléssel foglalkozó kutatók és klinikusok nem lesznek képesek reális indikációk és alkalmazási módok kimunkálására, illetve nem lesznek körültekintőek ezek bevezetésében, a regenerációs orvoslás megismételheti a korai génterápiás korszak hibáit.
A belátható jövőben az őssejtkezelés legfontosabb technikája, módszere a sejttranszplantáció lesz. Ez történhet frissen izolált embrionális őssejtekkel, in vitro indukált, modifikált felnőtt egyedből származó szöveti/szomatikus őssejttel, progenitor sejttel, valamint sejtvonalakkal. Jóllehet az in vitro indukció, az irányított differenciáció külön tudomány, és az őssejtvonalak előállításának is nagyon specifikus problematikája van, a végeredmény, a transzplantációra alkalmas sejt bejuttatásának, elhelyezésének alapelvei valamennyi esetben nagyon hasonlóak. Ez a fejezet az ezzel kapcsolatos legfontosabb kérdések és buktatók közül kíván néhányról tájékoztatni. Az őssejt-transzplantáció általános alapelveinek ismertetése után megemlítünk néhány ígéretes alternatív őssejtkezelési módszert is.
A sikeres sejtpótlás feltételei: optimális donor-, illetve sejtforrás, optimális környezet a recipiensben.
Értelemszerű, hogy ideális őssejtforrásnak az aktív regenerációra képes szöveteket tekinthetjük. Ezek legfontosabb tulajdonsága, hogy megtartották azokat az élettani sajátságokat és funkciókat, amelyek az őssejtek túléléséhez és differenciálódásához szükségesek, és képesek az egyes sejttípusok végső specializálódásához elengedhetetlen szignálok (citokinek, növekedési faktorok stb.) közvetítésére is. Ezt az alapelvet tökéletesen igazolja az őssejtkezelés mindmáig egyetlen igazán sikeres és széles körben elterjedt formája: a csontvelő-transzplantáció.
A kifejlett szervezet néhány szövetében (csontvelő, a gyomor-bélrendszer, illetve a kültakaró) is megmaradnak az őssejtek, és az egyed egész életében biztosítják a regenerációhoz szükséges utánpótlást. Hasonló folyamat biztosítja a hím ivarsejtek pubertás utáni folyamatos termelődését is. Valószínű az őssejtek perzisztálása a hasnyálmirigyben és a máj parenchymában is. A központi idegrendszerben is kimutattak proliferációra képes progenitor sejteket, de - néhány kivételtől eltekintve (szemgolyó, hippokampusz) - az idegrendszer regenerációja nem egyértelműen bizonyított.
Az agy, a vesék, a tüdők és a szívizom az embrionális fejlődés egy adott, specifikus fázisában alakulnak ki, és felnőtt korban nem tartalmaznak a regenerációhoz elégséges számú őssejtet. Károsodásuk ezért kiterjedt hegesedéshez, szövet-átépüléshez és súlyos funkciókieséshez vezet. A felismerés, hogy a limitált regenerációs kapacitással rendelkező szövetek pótlása az aktuális szövetből származó őssejtekkel nyilvánvalóan nagyon nehézkes, nagyban előmozdította azokat az elgondolásokat és törekvéseket, amelyek embrionális őssejteket, illetve embrionális őssejtvonalakat kívánnak hasznosítani.
A donor szövettípusa mellett alapvetően fontosnak tűnik az őssejtkezelés sikerének prognosztizálásában az adott betegség patomechanizmusának ismerete. Ideális donor őssejtek alkalmazása mellett is döntően fontos, hogy a kezelendő betegség intrinsic őssejtkárosodás következménye-e, vagy az őssejtekre ható, de azoktól független tényezők (például autoimmun betegség) váltják-e ki. Az intrinsic, genetikus őssejtkárosodás esetén egészséges donor őssejtekkel történő kezelés rendkívül eredményes, gyógyító hatású lehet (például Fanconi- és Diamond-Blackfan-szindróma vagy különböző genetikus immundeficienciák). Ha az őssejtkárosodás külső mechanizmusra vezethető vissza, az őssejtpótlás csak akkor effektív, ha egyidejű "neutralizáló" kezelés (például immunszuppresszió autoimmun aplasztikus anaemiában) is történik (Bacigalupo et al., 2000). Inzulin-dependens diabéteszben (IDDM) sem várható akár a béta sejtek, akár a hasnyálmirigyből származó őssejtek transzplantációjától végleges/tartós eredmény az autoimmun alapfolyamat hatékony kezelése nélkül.
Az őssejtek klinikai alkalmazásában további nehézséget jelenthet majd, ha a recipiens alapbetegsége súlyos károsodást okoz az őssejtek fejlődéséhez, végső differenciálódásához szükséges szöveti struktúrákban. A csontvelő-transzplantáció gyakorlatából ismerjük, hogy a bizonyos mieloproliferativ kórképekben kialakuló extenzív fibrózis meggátolhatja a normális vérképzés újraindulását, az aktív szöveti regenerációt (Gurevitch et al., 1999). Az őssejtkezelés után hasonló jellegű problémával kell a jövőben szembenézni egyéb betegségekben is. Az olyan próbálkozásoknak, ahol például előrehaladott cirrhosisban szenvedő betegekben a májparenchyma regenerálására őssejteket juttatnak direkt módon a szervbe (például intraportális injekcióval), feltehetően kevés tartós eredménye lesz. Hasonló a helyzet súlyos égés és marószer okozta bőrkárosodás után: a kifejezett hegesedés miatt a graft legtöbbször csupán barrier funkciót képes ellátni. Amíg nem vagyunk képesek effektíven megelőzni, illetve csökkenteni a hegesedést, nem várható kielégítő regeneráció a transzplantáció után, jóllehet a kültakaró rétegei tartalmaznak őssejteket, amelyek képesek lennének specializált bőrsejtekké differenciálódni.
Plaszticitás: terápiás lehetőség?
A különböző típusú őssejtek behatóbb megismerése révén alapelvként fogadtuk el, hogy differenciálódási képességüket tekintve az embrionális őssejtek pluripotensek, míg a kifejlett szervezetben található szomatikus őssejt kizárólag a rezidens szövettípus sejtjeinek pótlására képes. Az első tudományos eredmények a kifejlett szomatikus őssejt plaszticitásáról (ezt a fogalmat használjuk annak leírására, hogy ez a sejttípus is több irányba differenciálódhat) rendkívüli érdeklődést és bizonyos fokú nyugtalanságot váltottak ki: részben a beláthatatlan tudományos és a biomedicinális lehetőségek, részben pedig a nagyon is belátható egészségpolitikai/etikai következmények miatt.
Izomból, illetve az agyból izolált őssejtek képesek a csontvelő bizonyos funkcióit visszaállítani (Bjornson et al., 1999; Jackson et al., 1999). Hasonlóképpen, a csontvelői őssejtek is képesek transzdifferenciálódásra, teljesen eltérő szövetek (tüdő és bél epiteliális sejtek, hepatocita, neuron és szívizom) differenciált sejtjeinek fenotípusát és funkcióit kifejleszteni (Krause et al., 2001; Lagasse et al., 2000). Nem kívánunk itt a plaszticitás elméleti/kísérleti hátterével, azt igazoló, illetve annak ellentmondó eredményekkel foglalkozni, a kötet egyéb tanulmányai ezeket részleteikben tárgyalják.
A vita lényegében arról szól, hogy mennyiben végleges, determinált a kifejlett szomatikus őssejt sorsa, lehetséges-e (és ha igen, milyen mértékben) a genom totipotenciáját genetikai manipulációval felszabadítani"? A kérdés első részére minden bizonnyal igennel válaszolhatunk. Korai vizsgálatok kimutatták, hogy például az izomspecifikus fehérjék/enzimek expressziója nem-izom eredetű sejtekben is aktiválható (Blau et al., 1983). A Dolly-story is bebizonyította, hogy egy terminálisan differenciálódott, kifejlett sejt magjának átültetésével a sejt egy zigóta-fázisra jellemző állapotba újraprogramozható, és beindulhat a teljes szöveti/szervi fejlődés. Különösen ígéretesek a mesenchymalis őssejtekkel (MAPC - multipotential adult progenitor cell) nyert eredmények. Speciális tenyésztési körülmények "nyomására" ezek a sejtek hepatociták, neuronok vagy endotel sejtek sajátosságait, funkcióit produkálják (Schwartz et al., 2002; Reyés et al., 2002). Nem egyértelmű, hogy ezek a sejtek előfordulnak-e a csontvelőben, vagy csupán a tenyésztési körülmények hatására modifikálódnak: elképzelhető ugyanis, hogy a sejt eltávolítása a természetes integrin és citokin milieu-ből a normális génexpressziót szabályozó epigenetikus mechanizmusokat is károsítja. A MAPC sejtekben különböző módszerekkel elemezve valóban kimutatható e kontrollmechanizmusok zavara, ezek a sejtek "újraprogramozott“ állapotban vannak, ellentétben az embrionális őssejtekből magátvitellel kifejlesztett differenciált sejtekkel. A MAPC sejtekről tehát valóban elképzelhető, hogy szintén klinikai felhasználásra kerülnek, noha a kritikus tenyésztési körülmények egyike - az igen alacsony sejtsűrűség - komoly akadálya lehet a klinikai alkalmazáshoz elegendő számú sejt előállításának.
Bizonyos adatok alapján felvetődhet, hogy a plaszticitás nem valódi jelenség, és a változások a transzplantált sejtek és a recipiens szövet fúziójával magyarázhatók. Jóllehet in vitro kísérletekben valóban sikerült embrionális őssejteket hematopoetikus és neuronális őssejtekkel fuzionálni, az in vivo fúzió lehetőségének igazolása lényegesen bonyolultabb. Ezen megfigyelések alapján egyértelmű, hogy nagyon szigorú kritériumrendszer (a sejtvonalak megfelelő jelölése, klónanalízis stb.) szükséges az őssejt differenciálódási potenciájának monitorozásához.
A kifejlett szomatikus őssejt plaszticitását jelenleg még semmilyen klinikai alkalmazásban sem tudjuk kihasználni. Számos újabb kutatási eredmény ad ugyanakkor határozott reményt, hogy ezek a sejtek - függetlenül természetes differenciálódási adottságaiktól - újraprogramozva részei lehetnek a jövő terápiás fegyvertárának.
Milyen betegségeket fogunk kezelni?
Értelemszerű, hogy a csupán egy sejttípus/sejtvonal funkcionális kieséséből adódó kórképek tűnnek a legígéretesebb területnek az őssejtkezelés szempontjából. A Parkinson-kór és az IDDM kezelésében embrionális sejtekkel, illetve hasnyálmirigysziget-(béta)sejtekkel az utolsó évtizedben elért eredmények alapján várhatóan ez a két betegség lesz a kiterjedt, rutinszerű őssejt-alkalmazás első területe. Több mint húszéves, bár zömmel kis esetszámú, nem kontrollált tanulmányokból származó tapasztalat gyűlt össze Parkinson-kórban embrionális mesencephalikus szövettranszplantáció eredményességéről. A kontrollált klinikai vizsgálatok egyértelműen bebizonyították, hogy a graft képes a tartós túlélésre, és dopamint termel (Freed et al., 2001). Az eredményekben mutatkozó nagyfokú variabilitás ugyanakkor ismételten hangsúlyozza a korábban ismertetett alapelvek fontosságát: a megfelelő számú és specificitású/minőségű sejt mellett a recipiens szöveti milieu is rendkívül fontos (jelen esetben a sikeres funkcióhoz elengedhetetlen, hogy a transzplantált sejtek az agy megfelelő területére kerüljenek).
Parkinson-kórban a széleskörű klinikai alkalmazás szempontjából a legfontosabb korlátozó tényező a megfelelő mennyiségű dopaminerg neuron előállítása. Megfelelő tenyésztési körülmények mellett mind egér, mind humán embrionális őssejtek képesek in vitro dopaminerg neuronná differenciálódni. Ha kifejlett szomatikus őssejtekből elképzelhető is dopaminerg neuronok előállítása, kérdéses a szükséges mennyiség biztosítása: az embrionális őssejt ezen a területen egyelőre behozhatatlan előnyt biztosít.
IDDM a másik legfontosabb betegség, ahol az őssejtpótló kezelés óriási távlatokat nyit. A Parkinson-kórhoz hasonlóan egyelőre itt sem megoldott a szükséges sejtmennyiség előállítása. Számos eredmény bizonyítja, hogy a hasnyálmirigy vagy máj eredetű sejtek képesek in vitro inzulintermelő sejtekké differenciálódni, és állatmodellben a vércukorszint normalizálódása is elérhető. A klinikai tapasztalat, mely szerint a kadáverből nyert béta sejtek egyértelműen visszaállítják cukorbetegekben a szénhidrátanyagcsere egyensúlyát, az őssejtkezelés első számú célbetegségévé teszik az IDDM-t, betegek százezreinek csillantva fel a tartós tünetmentesség, a gyógyulás reményét.
Alternatív megközelítések: méhen belüli transzplantáció
Általános elv, hogy az őssejtkezelés a proliferáló szövetekben lehet igazán sikeres, ahol jelen vannak a differenciálódáshoz szükséges strukturális/funkcionális sajátosságok. Ez az embrió méhen belüli fejlődése során gyakorlatilag minden szövetre igaz. Külön előny lehet az immunrendszer "éretlensége", a fejlődő szervezet így sajátként fogadja el a transzplantált sejteket. Nem teljesen érett a vér-agy gát funkciója sem, így az intravénásan beadott sejtek nagyobb eséllyel érik el a központi idegrendszert. Az embrionális fejlődés szakaszait részletesen ismerjük, a sebészeti és radiológiai módszerek rendelkezésre állnak. A méh viszonylag könnyen hozzáférhető, így az egyes szövetek a terhesség különböző szakaszaiban célzottan kezelhetők.
A kísérletes adatok száma limitált, de patkányban és majomban is leírták az őssejtek sikeres integrálódását az agyba, méhen belüli transzplantációt követően. Jelenleg nem tudjuk, hogy a terhesség folyamán kivitelezett sejtpótlás az egyed teljes élettartamára biztosítaná-e a hiányzó/kóros sejt regenerációját. Méhen belüli transzplantációval a korai gyermekkorban kialakuló és a születés előtt abszolút biztonsággal diagnosztizálható betegségek kezelése jöhet szóba. Az így kezelhető kórképek között lehetnek a glikogéntárolás zavarai és az osteogenesis imperfecta.
In vitro szervelőállítás
Ez a megközelítés az őssejttenyésztés tapasztalatait kombinálja a biotechnológia legújabb eredményeivel a mesterséges szövetek előállításának területén. Speciális bioreaktorokban őssejteket vagy irányított differenciálódással kialakított specifikus sejteket tenyésztenek háromdimenziós, a szervezetben lebomló, immunológiai szempontból semleges struktúrákon. Az így létrehozott chipek alkalmasak a szövetpótlásra. Bizonyos termékek már széles körben elérhetők (csont, bőr, porc és simaizom). Biztató eredmények vannak endotél sejtek és simaizom kombinálásával (hólyagfal-pótlás), periodontális implantátumokkal, mesterséges erekkel és szaruhártyával kapcsolatban.
Különleges újdonságnak számít a "hibrid" struktúrák megjelenése. Ezekben mechanikai és/vagy elektronikus szerkezeteket építenek össze őssejtekből származó szövetekkel. Az elektromos/mechanikus jel ingerli a szövetet, amely feldolgozza és továbbítja az információt. Noha még csak nagyon kísérleti jelleggel, de az őssejtkezelés egyik sokat ígérő, új formájaként megjelentek a közép-/belső fül és a retinaimplantátumok is.
A legradikálisabb elképzelés: teljes emberi szervek előállítása sertésben. Az emberi őssejteket méhen belül transzplantálják a megfelelő szervbe. A kifejlett állatból eltávolított szerv sertéseredetű parenchymális sejtjei a recipiens szervezetben kilökődnének, míg a humán eredetű őssejtek fokozatosan átvennék ezek helyét illetve szerepét, kialakítva egy normális emberi szerv morfológiáját és struktúráját (Cai et al., 2002).
Összefoglalás
Az őssejtterápia, a regeneratív orvoslás leginkább akkor válhat sikeressé, ha az egyedi sejt szintjén reprodukálja a hagyományos szövet-/szervtranszplantáció eredményeit, követi az alapvető transzplantációs biológiai alapelveket, és folyamatosan megoldja a felmerülő specifikus, immunológiai jellegű problémákat. Az állandóan elérhető, reprodukálható és standardizált módszerekkel izolált őssejtek biztosítása elengedhetetlen. A szelektálási folyamatnak fokozatosan ki kell terjednie az aktuális sejttípus funkcionális értékelésére is: a tisztán fenotípus alapján kiválasztott sejtek működése a transzplantáció után nem lesz feltétlenül ideális. A kifejlett szervezetben előforduló, szomatikus típusú őssejtek közül csak a hematopoetikus, a neuronális és mezenchimális típusokról vannak kiterjedt ismereteink. Az őssejtek felhasználásának sikere - és a rutinszerű klinikai alkalmazás bevezetéséhez szükséges idő - nagymértékben függ az egyes specializált sejttípusok differenciálódásának genetikai és biokémiai szabályozásának a mainál sokkal mélyebb, átfogóbb megismerésétől. A legkomplexebb tanulmányok is azt igazolják, hogy az emberi őssejt sorsát in vitro csak igen kevéssé tudjuk befolyásolni: az in vitro kultúrákban egyrészt csökken a sejtek pluripotenciája, másrészt a változó tenyésztési körülmények függvényében a sejtek több-kevesebb sikerrel megindulnak a mezodermális, ektodermális vagy entodermális differenciálódási program útján. Az irányított differenciálódás módszereinek kifejlesztése kétségkívül nagyon korai fázisban van.
Nem képzelhető el a klinikai alkalmazás széles körű elterjedése megbízható állatmodellek nélkül sem. Bár minden állatmodell limitált, az őssejtkezelés alapvető hatásainak és hatásosságának felmérésére nincs más lehetőségünk. Kockázatosnak tűnik a betegek kezelésére gondolni, mielőtt nincsenek teljesen átfogó ismereteink a szöveti regeneráció mechanizmusairól sem. Ha csak az egérmodellben szerzett jelenlegi ismereteinkre szorítkozunk, nem tudjuk valóban megbízhatóan megjósolni egyetlen őssejtkezelési módszer klinikai sikerességét, hatásait.
Elkeseredett, kilátástalan helyzetben lévő betegek hajlamosak extrém kockázatot is vállalni. Az alapkutató és a klinikus közös feladata és felelőssége, hogy csak olyan projektek kerüljenek a klinikai kipróbálás fázisába, amelyek valóban gazdagítják ismereteinket, a még éppen vállalható rizikó árán. Az őssejteken alapuló kezelés forradalmasítani fogja a degeneratív, sejtpusztulással járó kórképek gyógyítását. A társadalom, a betegek megtaníthatók arra, hogy reális elvárásaik legyenek: a klinikai sikerek eléréséhez évek, esetleg évtizedek szükségesek.
Kulcsszavak: őssejt; sejttranszplantáció; őssejtterápia; Parkinson-kór; IDDM
Irodalom
Bacigalupo, Andrea - Brand, R. - Oneto, R. - Bruno, B. - Socie, G. - Passweg, J. - Locasciulli, A. - Van Lint, M. T. - Tichelli, A. - Mccann, S. (2000). Treatment of Acquired Severe Aplastic Anemia: Bone Marrow Transplantation Compared with Immunosuppressive Therapy - The European Group for Blood And Marrow Transplantation Experience. Seminars in Hematology. 37, 69-80
Bjornson, Christopher R. R. - Rietze, R. L. - Reynolds, B. A. - Magli, M. C. - Vescovi, A. L. (1999): Turning Brain into Blood: A Hematopoietic Fate Adopted by Adult Neural Stem Cells in Vivo. Science. 283, 534-537
Blau, Helen M. - Chiu, Choy - Pik - Webster, C. (1983): Cytoplasmic Activation of Human Nuclear Genes in Stable Heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180
Cai, Jingli - Rao, Mahendra S. (2002): Stem Cell and Percursor Cell Therapy. NeuroMolecular Medicine. 2, 3, 233-249
Freed, Curt R. - Greene, P. E. - Breeze, R. E. - Tsai, W. Y. - Dumouchel, W. - Kao, R. - Dillon, S. - Winfield, H. - Culver, S. - Trojanowski, J. Q. (2001): Transplantation of Embryonic Dopamine Neurons for Severe Parkinson's Disease. New England Journal Medicine. 344, 710-719
Gurevitch, Olga - Prigozhina, T. B. - Pugatsch, T. - Slavin, S. (1999): Transplantation Allogeneic or Xenogeneic Bone Marrow within the Donor Stromal Microenvironment. Transplantation. 68, 1362-1368
Hacein-Bey-Abina, Salima - Le Deist, F. - Carlier, F. - Bouneaud, C. - Hue, C. - De Villartay, J. P. - Thrasher, A. J. - Wulffraat, N. - Sorensen, R. - Dupuis - Girod, S. (2002): Sustained Correction of X - Linked Severe Combined Immunodeficiency by Ex Vivo Gene Therapy. New England Journal Medicine. 346, 1185-1193
Jackson, Kathyjo Ann - Mi, Tiejuan - Goodell, Margaret A. (1999): Hematopoietic Potential of Stem Cells Isolated from Murine Skeletal Muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 96, 14482-14486
Krause, Diane S. - Theise, N. D. - Collector, M. I. - Henegariu, O. - Hwang, S. - Gardner, R. - Neutzel, S. - Sharkis, S.J. (2001): Multi - Organ, Multi - Lineage Engraftment by a Single Bone Marrow - Derived Stem Cell. Cell. 105, 369-377
Lagasse, Eric - Connors, H. - Al - Dhalimy, M. - Reitsma, M. - Dohse, M. - Osborne, L. - Wang, X. - Finegold, M. - Weissman, L. L. - Grompe, M. (2000): Purified Hematopoietic Stem Cells Can Differentiate into Hepatocytes in Vivo. Nature Medicine. 6, 1229-1234
Reyés, Morayma - Dudek, A. - Jahagirdar, B. - Koodie, L. - Marker, P. H. - Verfaillie, C. M. (2002): Origin of Endothelial Progenitors in Human Postnatal Bone Marrow. Journal of Clinical Investigation. 109, 337-346
Schwartz, Robert E. - Reyés, M. - Koodie, L. - Jiang, Y. - Blackstad, M. - Lund, T. - Lenvik, T. - Johnson, S. - Hu, W. S. - Verfaillie, C. M. (2002): Multipotent Adult Progenitor Cells from Bone Marrow Differentiate into Functional Hepatocyte - Like Cells. Journal of Clinical Investigation. 109, 1291-1302.