Az Henri Becquerel által 1896-ban felfedezett jelenséget (Becquerel, 1896) 1898-ban Marie Curie nevezte el radioaktivitásnak. Röviddel a radioaktivitás felfedezése után Hevesy György felfedezte a nyomjelzési elvet és megalkotta a nyomjelzéstechnikát (Hevesy–Paneth, 1913), amely a fizikai, kémiai és élettudományok fontos kísérleti eszközévé vált. A módszer fejlődését a mesterséges radioaktivitás felfedezése (1935, Iréne Curie és Frédéric Joliot-Curie), majd a mesterséges radioizotópok előállítása jelentősen segítette. „A radioaktív izotópok indikátorként való alkalmazásáért a kémiai kutatásban” indoklással 1944-ben Hevesy György kapta a kémiai Nobel-díjat. Ez az úttörő munka tette lehetővé az élő szervezetben lezajló biokémiai és fiziológiai folyamatok dinamikai vizsgálatát, valamint a nukleáris medicina kifejlődését.

A nyomjelzéstechnikában, a kutatási problémák radioaktivitásmérésen alapuló megoldásakor az első lépés mindig a megfelelő radioizotóp kiválasztása. Ekkor elsősorban az izotóp felezési idejét, az ebből adódó moláris aktivitást, az izotóp által kibocsátott sugárzás fajtáját és energiáját, valamint a radioaktív jel jelzett molekulán belüli helyzetét kell megvizsgálni. A sugárzás jellemzői és a jelzett molekula kémiai, biológiai környezete határozza meg a radioaktivitás mérésére alkalmazandó módszert, míg a jelzett molekulák moláris aktivitása és a radioizotóp molekulán belüli helyzete a vizsgálat érzékenységét és specifikusságát befolyásolja. Biológiai rendszerek vizsgálatára elsősorban a H, C, N, O, P, S és I radioaktív izotópjai alkalmazhatók (1. táblázat). Ha a vizsgált rendszer valamely komponensébe ezen elemek izotópjait építjük be, a vizsgált, fiziológiai jelentőséggel bíró vegyület szerkezete, kémiai tulajdonságai alig változnak, így a nyomjelzéses kísérlettel csak minimális mértékben avatkozunk be az egyébként nem érzékelhető folyamatba, miközben mérhetővé tesszük azt. Az 1. táblázatban feltüntetett szénizotópok közül pl. a C-14 radioizotóp metabolizmusvizsgálatokban alkalmazható, amikor a szervezetbe juttatott jelzett vegyület lebomlásának útjai, dúsulásának helyei térképezhetők fel. Emellett az 5730 éves felezési ideje következtében radiokarbon-kormeghatározásra is használható a mintában még meglévő C-14-tartalom mérésével. Ezzel szemben a 20 perces felezési idejű, pozitront sugárzó C-11 izotóp a képalkotó diagnosztikai eljárások (pozitronemissziós tomográfia – PET és hibrid technikák) fontos nuklidja. Az élettudományi kutatásokban a β-sugárzó izotópok (H-3, C-14, P-32, S-35) felhasználása a legelterjedtebb. Új gyógyszerek fejlesztésében, a hatóanyagok metabolizmus- és farmakokinetikai vizsgálataiban főleg a C-14 és H-3 jelzett vegyületeket lehet alkalmazni. A fehérjeszintézis kutatásában a H-3, C-14, valamint S-35 jelzett aminosavakat, míg a nukleinsavak szintézisének vizsgálatára a P-32 és P-33 jelzett nukleotidokat alkalmazzák. Ez utóbbiaknak is köszönhető a modern genetika és génterápia kifejlődése. Az idegrendszer működésének tanulmányozására, neurológiai betegségek klinikai kutatásához, vagy a rákos betegségek diagnosztizálásához a rövid felezési idejű, pozitronsugárzó izotópokkal (C-11, N-13, O-15, F-18) jelzett vegyületek az alkalmas eszközök. Emellett természetesen jelentős diagnosztikai szerep jut a Tc-99m-nek és más radioaktív fémizotópoknak is.

Laboratóriumunkban elsősorban tríciummal jelzett vegyületeket állítunk elő, de C-14 és I-125 izotópos jelöléseket is rendszeresen végzünk. A továbbiakban a trícium nyomjelzéstechnikai alkalmazására fokuszálunk. A trícium ideális radionuklid biológiai jelentőséggel bíró molekulák jelöléséhez. Felezési ideje 12,35 év, így viszonylag nagy moláris aktivitású jelzett vegyületek előállítására ad lehetőséget. Ezenkívül tiszta β– sugárzásának maximális energiája csupán 18,6 keV, és a szervezetben tartózkodását leíró biológiai felezési ideje is rövid, 12 nap, ezért biztonságosan használható fel, egészségkárosító kockázata alacsony. Sugárzásának alacsony energiájából ered az a hátrányos tulajdonsága, hogy csak kis hatásfokkal mérhető, folyadékszcintillációs módszerrel is legfeljebb 60% érhető el. Előnyös azonban, hogy a trícium viszonylag olcsón előállítható megnövelt Li-6 tartalmú Li-Mg ötvözet neutronbesugárzásával, és a kapott trícium gázt hidrogénezési eljárásokban alkalmazva a H-3 jelzett vegyületek egyszerűen preparálhatók.

A trícium beépítése izotópcsere-reakciókkal, direkt kémiai szintézissel és biokémiai, enzimatikus reakciókkal történhet. A trícium gáz és a szerves molekulák hidrogénatomjai közötti cserereakciók végbemenetelét a trícium sugárzási energiája teszi lehetővé. Így azonban alcsonyabb moláris aktivitású jelzett vegyületek állíthatók elő, és ezekben a radioaktív atomok helyzetét csak statisztikai úton becsülhetjük. A modern élettudományi kutatások által igényelt magasabb moláris aktivitású, specifikusan jelzett vegyületek előállítására direkt kémiai szintézist kell alkalmazni. Ekkor a kémiai reakciók által meghatározott pozíciókba építhetjük be a radioaktív jelet, és a molekulán belüli izotópeloszlás tekintetében is homogén terméket – nyomjelzett kísérleti eszközt kapunk. A jelölést elsősorban trícium gázzal végzett hidrogénezési reakcióval vagy fém-tritidekkel végzett redukcióval hajtjuk végre. Figyelemre méltó, hogy a trícium atomtömege háromszor nagyobb, mint a próciumé (könnyűhidrogéné), így az izotópeffektus jelentős. Végeredményben a kapott H-3 jelzett vegyület alkalmazhatóságát a beépített radioaktív atom kémiai stabilitása és a jelzett vegyület radiolízissel

szembeni érzékenysége határozza meg. Legstabilabb a trícium jel, ha szénatomhoz kötődik, ezzel szemben labilis a jel, ha heteroatomhoz (O, N, S) kötődik. Érdemes megkülönböztetni savakra, bázisokra érzékeny és biolabilis pozíciókat is, mivel így a felhasználás körülményeinek megválasztásában segítünk.

Laboratóriumunkban az opioid receptorrendszerekkel foglalkozunk. Az opioid receptorok (morfinreceptorok) jelenlétét 1973-ban tríciált morfin, naloxon és etorfin felhasználásával radioreceptor-kötési vizsgálatokkal bizonyították, majd azonosították azok kis molekulatömegű endogén peptid ligandumait (enkefalinok, dinorfinok, endomorfinok) is (Pasternak, 2004). (A ligandumok kis molekulatömegű vegyületek, amelyek a nagy molekulatömegű receptor molekulához kötődnek.) Mivel az opioid rendszer nagyon összetett és az egyes receptorfehérjék szerkezete mindmáig ismeretlen, ezért rengeteg radioligand receptor kötési kísérleten alapuló szerkezet-hatás összefüggésvizsgálatot végeztek az ideális, specifikus hatást kiváltó, mellékhatásoktól mentes opioid fájdalomcsillapítók fejlesztése érdekében. Csoportunkban számos, az opioid receptorok kutatásában alkalmazott H-3 jelzett alkaloid és peptid típusú radioligandum előállítását dolgoztuk ki. A peptidek aminosavakból felépülő vegyületek, ahol az N-terminális rész (-NH₂) a vegyület elejét és a C terminális rész (-COOH) a végét jelenti. Az élő szervezetben jelenlévő proteolitikus enzimek bontják a peptid kötéseket, így a peptidek kevesbé stabil vegyületek. Ezért fontos, hogy béta aminosavak legyenek a peptidekben, hogy enzimekkel szemben ellenálló vegyületeket kapjunk. A tríciált peptideket általában a megfelelő prekurzor peptidekből trícium gáz és palládium katalizátorok felhasználásával állítjuk elő (Tóth et al., 1997; 1. ábra). Redukcióra érzékeny peptidek esetében tríciált aminosavak felhasználásával lépésenkénti peptidszintézist alkalmazunk a jelzett peptidek előállítására.

Az opioid peptidek családjába tartozó endomorfinokat (endomorfin-1: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂, endomorfin-2: Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂) James E. Zadina és munkatársai izolálták marhaagyból (Zadina et al., 1997). A két tetrapeptid amid a μ opioid receptorok endogén liganduma, nagy affinitással és szelektivitással aktiválják azt. Emiatt az endomorfinok új analgetikumok fejlesztésére alkalmas vezérvegyületek. Publikálásukat követően azonnal előállítottuk az endomorfinok több H-3 jelzett származékát. A szintézisekhez a 2. táblázatban felsorolt prekurzor endomorfinszármazékokat használtuk fel. Ezek katalitikus dehalogénezésével vagy telítésével olyan nagy moláris aktivitású izotopomereket kaptunk, amelyek a radioaktív jelet különböző aminosavakban hordozták. A kapott radioligandumokat receptorkötődési vizsgálatokban jellemeztük, majd patkányagyban történő degradációs vizsgálataikkal bizonyítottuk, hogy proteolitikus lebomlásuk a Pro² és a Trp³/Phe³ aminosavak közötti peptidkötés hasadásával kezdődik, és a képződő dipeptidek hidrolízisével végződik. A metabolizmusvizsgálatok eredményeiből kiindulva proteolitikus enzimekkel szemben ellenálló, új endomorfinszármazékokat állítottunk elő, ahol a Pro² aminosavat aliciklusos béta aminosavakkal (2-amino-ciklopentán karbonsav – Acpc; 2-amino-ciklohexán karbonsav – Achc) helyettesítettük, illetve dimetil-tirozint építettünk az N-terminális pozícióba. Mivel az így kapott vegyületek megőrizték μ opioid receptor affinitásukat, és az enzimatikus stabilitásuk is nőtt, ezért néhányat tríciummal is jelöltünk. Az ehhez szükséges új prekurzor aminosavakat a 2. ábra mutatja, ezek kereskedelmi forgalomban nem kaphatóak, és mi alkalmaztuk elsőként radioaktív jelölés prekurzoraiként.

A tríciált peptidek a fluoreszcencia mérésén alapuló technikák elterjedése mellett még mindig jelentős kutatási eszközök, hiszen éppen a vizsgált molekulával való kémiai azonosságuk teszi lehetővé az abszolút szerkezet-hatás vizsgálatokat. Így ismeretlen szerkezetű receptor fehérjéken végzett radioligandum kötési vizsgálatokkal nagyszámú vegyület affinitása vizsgálható, autoradiográfiás mérésekkel az adott receptorok szöveti eloszlása vizualizálható. Ezenfelül a radioaktív peptidek enzim inhibitorok jellemzését is segíti, illetve az elsősorban I-125 jelzett vegyületek a radioimmunoassay (RIA) módszerek antigénjei.
 

Kulcsszavak: radioaktivitás, nyomjelzéstechnika, trícium jelölés, radionuklidok kiválasztása, neuropeptidek, opioidok, endomorfinok
 

IRODALOM

Becquerel, Henri (1896): Sur les radiations émises par phosphorescence. Comptes Rendus. 122, 420. •  WEBCÍM >

Hevesy, George de [György] – Paneth, F. (1913): The Solubility of Lead Sulphide and Lead Chromate. Zeitschrift für anorganische Chemie. 82, 322–327.

Pasternak, Gavril W. (2004): Multiple Opiate Receptors: Déjá Vu All over Again. Neuropharmacology. 47, 312–323. DOI:10.1016/j.neuropharm.2004.07.004

Tóth Géza – Lovas S. – Ötvös F. (1997): Tritium Labelling of Neuropeptides. In: Irvine, G. Brent – Williams, Carvell H. (eds.): Molecular Biology, Neuropeptide Protocols. Humana Press: Totowa, NJ, 219–230. • WEBCÍM >

Zadina, James E. – Hackler, L. – Ge, L-J. – Kastin A. J. (1997): A Potent and Selective Endogenous Agonist for Mu-opioid Receptor. Nature. 386, 499–502. DOI:10.1038/386499a0