A Magyar Tudományos Akadémia folyóirata. Alapítva: 1840
 

KEZDŐLAP    ARCHÍVUM    IMPRESSZUM    KERESÉS


 FOTOPOLIMERIZÁCIÓVAL KÉSZÍTETT MIKROSTRUKTÓRÁK

    ALKALMAZÁSA A BIOFIZIKÁBAN

X

Ormos Pál

az MTA rendes tagja, főigazgató, MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biofizikai Intézet • ormos.pal(kukac)brc.mta.hu

 

Az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biofizikai Intézetében körülbelül tíz éve meghonosítottuk a fotopolimerizációs mikrostruktúra-építés technikáját. E módszerrel tetszőlegesen bonyolult, néhányszáz nm-es térbeli feloldású alakzatokat tudunk építeni – ehhez mérten tetszőleges méretekben. Ilyen testeket először optikai mikromanipulációs kísérletekben használtunk, később többféle technikában is sikeresen alkalmaztuk őket, mondhatni, ma intézetünk kísérleti tevékenységének jelentős része ilyen alakzatok alkalmazására épül. A jelen írás szerepe az intézet jellegzetes kutatási irányának bemutatása, ezért magától értetődő, hogy e területre vonatkozó aktivitásunkat írjuk le. Ismertetem tehát először a struktúraépítési technikát, majd pedig bemutatok néhány kutatási témát, amelyek ilyen struktúrák alkalmazására épülnek.


Mikrostruktúra-építés fotopolimerizációval


A fotopolimerizációs struktúraépítés fényre keményedő műanyagok alkalmazásán alapul. Egy folyadék halmazállapotú műanyagból indulunk ki, amely fénygerjesztés hatására polimerizálódik, megkeményedik. A struktúra építésének tehát az a folyamata, hogy megfelelő helyeken megvilágítjuk az anyagot, ott az megkeményedik, kialakul a kívánt alakzat, ezt követően a maradék folyadékot eltávolítjuk (előhívjuk a testet). Ilyen eljárással egyébként nagy testek is készíthetők, ipari termékek modelljeit, akár sebészeti protéziseket is gyártanak így. A mi esetünkben a kis méretek a jellemzők. A legkisebb méretek lézer gerjesztéssel érhetők el, a fény hullámhossza a meghatározó mérettartomány. Ha lézerfényt mikroszkópobjektívvel fókuszálunk, és kétfotonos gerjesztést alkalmazunk, néhány száz nanométeres jellemző méretű legkisebb térfogat alakítható ki, vagyis ez a létrehozható szerkezetek térbeli feloldása. A legegyszerűbb eljárásban a fókuszált lézerfényt számítógépes vezérléssel megfelelő pályán mozgatva mintegy kirajzoljuk az elkészítendő testet (Galajda – Ormos, 2001). Nyilvánvaló az eljárás óriási előnye: a fókusz tetszőleges pályán mozoghat, vagyis a kialakított test alakja akármilyen bonyolult lehet. A testek mérete jellemzően a mikrométeres tartomány, a felső határt a kialakítás időtartama korlátozza. Kifejlesztettünk alapvetően a gyorsítást elősegítő megvilágítási eljárásokat is: például egyetlen fókuszált nyaláb helyett többszörözött nyalábbal egyszerre több testet is rajzolhatunk, holografikus úton a mintát egyetlen megvilágítással is létrehozhatjuk stb. (Kelemen et al., 2007) Az 1. ábrán egy érdekes, meglehetősen bonyolult, pár mikrométeres testet mutatunk be.


Speciális alakú testek
optikai mikromanipulációja


Az optikai mikromanipuláció ma már a biofizika széles körben alkalmazott nagy teljesítményű kísérleti eljárása. Azon alapul, hogy a mikrométeres mérettartományban a fény nyomásából eredő erő elegendően nagy ahhoz, hogy ilyen mikroszkopikus testeket mozgasson, megragadjon. Fókuszált lézerfény a környezeténél nagyobb optikai törésmutatójú mikrométeres testeket a fókuszban rögzíti, mintegy csapdázza, a jelenséget, illetve az eszközt optikai csapdának, optikai csipesznek hívják. Az eszköz által pN nagyságú erők fejthetők ki, ez éppen a baktériumok mozgásával, a biológiai makromolekulák működésével kapcsolatos erők nagyságrendje – ez a szerencsés egybeesés az alkalmazhatóság alapja.

A lézerfény és a megragadott test kölcsönhatását természetesen befolyásolja a test alakja. A forma megfelelő alakításával a kölcsönhatás mintegy irányítható, azaz a megfelelő alakú testtel speciális manipulációs lehetőségeket lehet létrehozni. Íme néhány példa: propeller alakú testek lézercsipeszben megragadva forogni kezdenek. A forgás alapja a fénynyomás, teljesen analóg módon a szélmalom esetével: a propellerre jutó fény a ferde lapátokról szóródva ugyanúgy forgást kelt, mint a malom vitorláin eltérített szél. Az ilyen fény hajtotta propellerekkel összetett, ugyancsak fotopolimerizációs eljárással előállított mikromechanikus gépeket lehet hajtani, egészen bonyolult mikrométeres rendszerek készíthetők és működtethetők tehát így (Galajda – Ormos, 2001). Készítettünk például mikrofluidikai eszközökben alkalmazható integrált optikai motort, folyadékpumpát stb. (Kelemen et al., 2006)

E propellerek, azon túl, hogy fény hajtotta motorokként működnek, nagyon jól szolgálhatnak biológiai rendszerek mozgásának modellezéséhez is. Jelenleg is folyó kísérletsorozatunkban például a hidrodinamikai szinkronizáció jelenségét tanulmányozzuk velük (Di Leonardo et al., 2012). A biológiai mikrovilágban a mozgás keltése gyakran csillók csapkodásával, flagellák forgásával történik. Általában több ilyen szervecske mozog egyszerre, és a csapkodás, forgás szinkronizáltan zajlik. Régi kérdés, mi e szinkronizáció oka. Két alapvető lehetőség van: a szinkronizáció eredhet a mozgató egységek összehangolt működéséből, de lehet egyszerű hidrodinamikai oka is, mégpedig az, hogy az egymáshoz közel mozgó testek a köztük levő folyadék által kölcsönhatásba kerülnek, és e kölcsönhatás eredményezi az egyszerre zajló mozgást. E második lehetőséget már korábban felvetették, meggyőző kísérleti bizonyítékot azonban eddig nem sikerült adni. Fény hajtotta propellerjeinket alkalmaztuk a kérdés vizsgálatára, hiszen a mozgás közben ható erők hasonlóak a valóságban is fellépőekhez. Nagyon lényeges további jellemző a testek mérete. A kialakított modelljeink nagysága megfelel a valóságban szinkronizálódó testekének. A méret rendkívül fontos a mozgás jellegének meghatározásában. A hidrodinamikai jelenségek modellezésénél az áramlást jellemző Reynolds-szám azonossága kulcskérdés – esetünkben a Reynolds-szám nagyon kicsi. Ugyancsak a méret a döntő a Brown-mozgás nagyságában: a mikrovilágban zajló mozgásokban a Brown-fluktuáció nagyon nagy összetevő. (Egyébként e két jellemző – a kis Reynolds-szám, illetve a nagy Brown-fluktuáció – miatt a mikroszkopikus testek mozgása folyadékokban nagyon más, mint amit makroszkopikus világunkban tapasztalunk).

A kísérlet a következő: holografikus úton létrehoztunk két optikai csapdát. A bonyolult optikai rendszerben lehetőség van a csapdák valamennyi paraméterének tetszőleges beállítására: a csapdák távolsága, a csapda erőssége szabadon változtatható. E csapdákban megragadtunk egy-egy propellert. E propellerek az előzőek szerint a csapdákban forogni kezdenek. A rendszerünkben tehát a forgó testek helyzetét és forgási sebességüket (hiszen ez arányos a csapdázó fény intenzitásával) tetszőlegesen változtathattuk. Ha a forgó propellereket közel vittük egymáshoz és a forgási sebességüket közel egyenlővé tettük, forgásuk szinkronizálódott: együtt kezdtek forogni, mintha fogaskerékkel össze lettek volna kapcsolva. Kimutattuk tehát a tiszta fizikai kölcsönhatáson alapuló hidrodinamikai szinkronizációt. Rendszerünkben ráadásul a meghatározó fizikai paraméterek, mint a forgó testek alakja, mérete, távolsága, a rájuk ható forgatónyomatékok nagysága stb., szabadon változtatható, a kölcsönhatás részletes fizikai jellemzését meg lehet tenni. A jelenség teljes megértését az jelenti, hogy létrehozunk egy fizikai modellt, amely pontosan leírja a megfigyelt folyamatokat. A modell ellenőrzéséhez szükség van a paraméterek változtatására, így a modell alapján meghatározhatók a fizikai jellemzők, mint a kölcsönhatás potenciálja stb. Kísérleti rendszerünkkel kimerítően jellemezni tudtuk a folyamatokat. Ezáltal a modell részleteiben tesztelhető, a jelenségkör szinte tetszőleges részletességgel tanulmányozható. Azon túl, hogy az alapjelenséget igazoltuk, azaz, hogy a biológiai rendszertől független hidrodinamikai kölcsönhatások képesek a megfigyelt szinkronizáció létrehozására, lehetőségünk nyílik a nagyon érdekes hatás további tanulmányozására. A mikrovilágban zajló áramlási folyamatok sokféle nem várt, meglepő viselkedést produkálnak, és ezek megértése természetesen nagyon fontos a biológiai mikrovilág megismeréséhez is.

Bemutatjuk a sajátos alakú testek optikai manipulációjának egy másik, általunk kidolgozott változatát is. Ha az optikai csipeszben lineárisan polarizált fényt alkalmazunk, és a csapdázott test lapos, a csapdázás során a test orientálódik. Az orientáció iránya olyan, hogy a test lapos felülete a polarizáció síkjába kerül (Galajda – Ormos, 2003). E hatás nyilvánvalóan növeli az optikai manipuláció lehetőségeit, hiszen a céltest helyzetének teljes meghatározására nyílik így mód. Tekintve, hogy a mikroszkopikus biológiai objektumok (baktériumok, sejtorganellumok, kromoszómák stb.) általában nem gömb alakúak, ezért ezzel az eljárással pontosan orientálni tudjuk őket, ez számos vizsgálat során előnyös lehet (Garab et al., 2005). További fontos új lehetőség, hogy e hatás alapján a megragadott testeken forgatónyomatékot tudunk mérni, illetve forgatónyomatékot tudunk kifejteni. Ha ugyanis az orientált testet egy rá ható forgatónyomaték az egyensúlyi helyzetéből kitéríti, a csapda visszatérítő forgatónyomatékot fog kifejteni – kis kitéréseknél e visszatérítő nyomaték arányos a kitéréssel. Így tehát forgatónyomatékot tudunk kifejteni egyszerűen úgy, hogy az orientáló fény polarizációs síkját elfordítjuk. Hasonlóképpen, meg is tudjuk mérni a testre ható forgatónyomatékot, hiszen ha ismerjük a fény polarizációjának irányát (ezt mi állítjuk be), valamint megmérjük a csapdázott lapos test orientációjának az irányát, a kettő különbségéből azonnal adódik a testre ható forgatónyomaték. Mondhatni, létrehoztunk egy mikroszkopikus nyomatékkulcsot, hiszen a működés teljesen analóg például az autószerelésben használt eszközzel. Természetesen az alkalmazáshoz szükség van a nyomatékkulcs kalibrálására, azaz ismernünk kell, hogy adott szögelfordulás mekkora nyomatéknak felel meg. Ráadásul ezt a kalibrációt minden mérés esetén el kell végezni, hiszen értéke nagyon függ a test pontos alakjától, valamint a csapda paramétereitől. Szerencsére ezt meg lehet tenni, a Brown-fluktuáció ad rá aránylag egyszerű lehetőséget: a fluktuáció nagysága egyértelműen függ a csapda orientációs rugóállandójától, és a meghatározásához szükséges fizikai paraméterek megmérhetők minden egyes kísérletben.

 

 

A jelenség jellemző alkalmazásaként meghatároztuk egyetlen kettős szálú DNS-molekula torziós rugalmasságát. A hélix alakú DNS-molekula esetében a csavarodás nyilvánvalóan nagyon fontos deformáció: a DNS szinte minden kölcsönhatása (a benne tárolt információ kiolvasása, a kromoszómák összeállítása, a hibák kijavítása stb.) a molekula csavarodásával jár együtt. Ezért azután a molekuláris események megértéséhez a torziós tulajdonságok ismerete elengedhetetlen. Próbálták is régóta meghatározni a jellemző értékeket, korábban azonban csak közvetett kísérletekre volt lehetőség, és a fizikai paramétereket meglehetősen bonyolult, részleteiben nem alátámasztott modellek segítségével lehetett meghatározni.

Kísérleteinkben hosszú l DNS-molekulákat használtunk. Egyik végüket mikroszkóp tárgylemezéhez rögzítettük, a másikra pedig néhány mikrométer átmérőjű lapos korongokat ragasztottunk. Ezeket ragadtuk meg a lineárisan poláros fénnyel képzett optikai csipeszben. A csipesszel kifeszítettük a DNS-molekulát, és a csapda polarizációs síkjának változtatásával tetszőlegesen „csavargathattuk” is. A kísérletben tehát mind a feszítési erő, mind pedig a csavarodás szabadon változtatható. Egyúttal (hiszen a fény polarizációjának iránya és a lapos korong helyzete is pontosan meghatározható) a DNS-molekulára ható csavaró forgatónyomaték is mérhető. Így tehát meg tudtuk mérni, hogy ismert forgatónyomaték mekkora elcsavarodást okoz a DNS-molekulán – ráadásul különböző kifeszítések esetén. Végeredményben tehát egyetlen molekulán közvetlen méréssel határoztuk meg e fontos fizikai paramétert. A módszer új lehetőségeket nyújt a biológiai makromolekulák egyenkénti tanulmányozására – forgatást igénylő vizsgálati eljárásban, illetve forgással járó jelenségek jellemzésében eddig nem elérhető megközelítés válik lehetségessé.


Integrált optikai eszközök


A fotopolimerizációs struktúraépítési eljárás sokoldalúságát illusztrálja egy további, meglehetősen eltérő kutatási területünk. A módszerrel integrált optikai eszközök is építhetők, sokféle biofizikai alkalmazással. A fényvezetők a modern integrált optika kulcskomponensei. Az eszköz központi eleme egy, a környezeténél nagyobb optikai törésmutatójú vezető közeg. Ismeretes, hogy ha a fény belülről nagyobb törésmutatójú közeg határára érkezik, teljes visszaverődés történik, amennyiben megfelelő irányban (a teljes visszaverődés határszögénél nagyobb szögben) érkezett oda. Így azután a megfelelő irányú fény a nagyobb törésmutatójú közegben marad. Ez az alapja annak, hogy a fényvezetőkben úgy vezethető a fény, mint elektronok a huzalokban. A fényvezetők szerkezete tehát a következő: nagy törésmutatójú vezető mag kisebb törésmutatójú köpennyel körülvéve. Lehetnek szál alakúak (ez a közismert optikai szál), de bonyolult struktúrák részeit is képezhetik. A fotopolimerizációs fényvezető készítés alapja, hogy vannak olyan fényre keményedő műanyagok, amelyek átlátszóak, és törésmutatójuk is megfelelő a célra. Mi üvegfelületen építünk fényvezetőket olyan polimerekből, amelyeknek az optikai törésmutatója tehát nagyobb az üvegénél. A készítés folyamata a következő: az üvegfelületre felviszünk egy folyadék halmazállapotú gyantaréteget, majd fókuszált lézergerjesztéssel „belerajzoljuk” a kialakítandó alakzatot. A nem megkeményedett folyadék leoldásával kialakul a végleges eszköz. Tetszőleges kétdimenziós fényvezető hálózat, „optikai integrált áramkör” építhető az eljárással. Illusztráló felhasználásként a Mach–Zehnder-interferométer készítését és alkalmazását mutatjuk most be. A Mach–Zehnder-interferométer sokoldalú optikai eszköz: működésének alapja, hogy az interferométerbe jutó fényt kettéosztjuk, majd bizonyos távolság után újra egyesítjük. Az újraegyesítéskor a két fény interferenciát szenved. Attól függően, hogy a szétválasztott szakaszon az optikai úthosszak mennyire különbözőek, a két fény különböző fázisban fog találkozni, ez pedig az interferenciát befolyásolja – gyengíteni, vagy erősíteni fogják egymást. Ezzel az eszközzel nagyon érzékenyen lehet mérni az optikai úthossz megváltozását.

Az általunk használt megoldás részletezése előtt a fényvezetőben vezetett fény jellegzetességét kell áttekintenünk. A teljes visszaverődésnek sajátos tulajdonsága, hogy visszaverődéskor a fény kissé kijut a kisebb törésmutatójú közegbe is, ennek mértéke összemérhető a fény hullámhosszával. Ezt a kis törésmutatójú közegbe átnyúló fényt evaneszcens fénynek hívják. A fényvezető magját körülvevő anyag ezek szerint hatással lesz a vezetett fény terjedésére is. Ezt az evaneszcens jelleget használjuk ki az integrált optikai Mach–Zehnder-interferométer használatakor. Az alkalmazásokban anyagok törésmutató változásait mérjük nagy érzékenységgel. Az eszköz kulcsa a kettéosztott fény, amint a fényvezetőben halad. A vizsgálandó anyagot az egyik ág felületére visszük. Ha az anyag törésmutatója megváltozik, megváltozik az ágban az optikai úthossz is, módosul az interferencia, és ez a kimeneten a fény intenzitásának a változásában nyilvánul meg. Az eszköz kivitelét a 2. ábrán mutatjuk be.

A törésmutató megváltozásán alapuló alkalmazások között magától értetődik a szenzorika. Az eszköz aktív felülete az interferométer oldalágának fényvezetője. Ha például ennek a felületét beborítjuk egy szelektív anyaggal, annak kölcsönhatása akár egyetlen molekulával is detektálható lesz a felület törésmutatójának megváltozásán keresztül. Ily módon többek között antigén–antitest kölcsönhatások vizsgálhatók kvantitatív módon, amint azt kísérleteinkben megvalósítottuk (Dér et al., 2010). Kiemelendő, hogy ebben az eljárásban mindenféle jelölőanyag nélkül érhető el a nagyérzékenységű detektálás, ellentétben például a jelenleg standard eljárásnak számító ELISA-módszerrel. Az eljárás igen egyszerűen használható, nagyon nagy érzékenységű szenzorokat eredményez. Ráadásul a technika könnyen kombinálható a mikrofluidikával, vagyis a modern diagnosztika számos területén ígér hatásos alkalmazást.

Ugyanezzel az elrendezéssel optoelektronikai logikai elemek is készíthetők. Láttuk, az eszköz úgy működik, hogy a kimenet szabályozható a szabályozó felület törésmutatójának a változásával. Ha tehát megfelelően irányítható törésmutatójú anyaggal rendelkezünk, az interferométer aktív optikai elemként, optikai kapcsolóként tud működni. Nagy tapasztalattal rendelkezünk megfelelő tulajdonságokkal rendelkező biológiai anyaggal: a bakteriorodopszin kromoprotein kiváló anyag ilyen alkalmazásra. A bakteriorodopszin membránfehérje, fény hajtotta transzmembrán protonpumpa. Biológiai funkciója a fényenergia átalakítása a membrán két oldala közti protonkoncentráció-különbség elektrokémiai energiájává – ezt később a baktérium hasznosítja különféle energiaigényes életfolyamataiban. A biológiai szereptől teljesen függetlenül érdekes tulajdonsága a bakteriorodopszinnak, hogy fénygerjesztést követően nagyon megváltozik a színe. E színváltozás természetesen az optikai törésmutató változásával jár együtt. Ezért ha a Mach–Zehnder-interferométer aktív felületét bakteriorodopszinnal vonjuk be, az eszköz fényáteresztő képességét a bakteriorodopszin felület megvilágításával a törésmutató-változáson keresztül modulálni tudjuk. Kialakítottunk egy fénnyel vezérelt fénykapcsolót; ez a jövő optikai adatfeldolgozó eszközeinek fontos komponensévé válhat (Dér et al., 2007). Ráadásul a kapcsolás sebessége nagyon nagy lehet. A bakteriorodopszin fotoreakciói nagyon gyorsak: a gerjesztést követő leggyorsabb színváltozási reakció pikoszekundumnál is rövidebb idő alatt lezajlik, vagyis akár ilyen sebességű optikai kapcsolás is lehetséges az eszközzel, ezt a közelmúltban megvalósítottuk (Fábián et al., 2011). Ez jelentősen meghaladja az elektronikus adattovábbításban jelenleg használatos kapcsolók sebességét.

Remélem, a példák meggyőzően illusztrálták a fotopolimerizált mikrostruktúrák alkalmazásának érdekes lehetőségeit.
 



Kulcsszavak: fotopolimerizáció, biológiai mozgás, optikai manipuláció, biofotonika
 


 

IRODALOM

Dér András – Valkai S. – Mathesz A. – Ando I. – Wolff, E. K. – Ormos P. (2010): Protein-Based All-Optical Sensor Device. Sensors And Actuators B-Chemical. 151, 1, 26–9. • WEBCÍM >

Dér András – Valkai S. – Fábián L. – Ormos P. – Ramsden, J. J. – Wolff, E. K. (2007): Integrated Optical Switching Based on the Protein Bacteriorhodopsin. Photochemistry and Photobiology. 83, 2, 393–396. DOI: 10.1562/2006-06-21-RA-944

Fábián L. – Heiner, Z. – Mero, M. – Kiss M. – Wolff, E. K. – Ormos P. – Osvay K. – Dér A. (2011): Protein-Based Ultrafast Photonic Switching. Optics Express. 19, 18861–18870. • WEBCÍM >  • WEBCÍM >
Galajda Péter – Ormos Pál (2001): Complex Micromachines Produced and Driven by Light. Applied Physics Letters. 78, 249–251. • WEBCÍM >

Galajda Péter – Ormos Pál (2003): Orientation of Flat Particles in Optical Tweezers by Linearly Polarized Light. Optics Express. 11, 446–451. • WEBCÍM >

Garab Győző – Galajda P. – Pomozi I. – Finzi L. – Praznovsky T. – Ormos P. – Van Amerongen, H. (2005): Alignment of Biological Microparticles by Polarized Laser Beam. European Biophysics Journal. 34, 335–343. DOI: 10.1007/s00249-004-0454-8

Kelemen Lóránd – Valkai S. – Ormos P. (2006): Integrated Optical Motor. Applied Optics. 45, 2277–80. • WEBCÍM >

Kelemen Lóránd – Valkai S. – Ormos P. (2007): Parallel Photopolymerisation with Complex Light Patterns Generated by Diffractive Optical Elements. Optics Express. 14488–14497. • WEBCÍM >

Di Leonardo, Roberto – Búzás A. – Kelemen L. – Vizsnyiczai G. – Oroszi L. – Ormos P. (2012): Hydrodynamic Synchronization of Light Driven Microrotors. Physical Review Letters. 109, 034104

Oroszi László – Galajda P. – Kirei H. – Bottka S. – Ormos P. (2006): Direct Measurement of Torque in the Optical Trap and Its Application to

Double-Strand DNA. Physical Review Letters. 97. 058301. DOI: 10.1103/PhysRevLett.97.058301

 


 

 

1. ábra • Kétfotonos gerjesztésű fotopolimerizációval előállított mikrométeres alakzat <
 


 

 

2. ábra • A fotopolimerizációval kialakított integrált optikai Mach–Zehnder-interferométer sémája <