Az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biofizikai
Intézetében körülbelül tíz éve meghonosítottuk a fotopolimerizációs
mikrostruktúra-építés technikáját. E módszerrel tetszőlegesen
bonyolult, néhányszáz nm-es térbeli feloldású alakzatokat tudunk
építeni – ehhez mérten tetszőleges méretekben. Ilyen testeket először
optikai mikromanipulációs kísérletekben használtunk, később többféle
technikában is sikeresen alkalmaztuk őket, mondhatni, ma intézetünk
kísérleti tevékenységének jelentős része ilyen alakzatok alkalmazására
épül. A jelen írás szerepe az intézet jellegzetes kutatási irányának
bemutatása, ezért magától értetődő, hogy e területre vonatkozó
aktivitásunkat írjuk le. Ismertetem tehát először a struktúraépítési
technikát, majd pedig bemutatok néhány kutatási témát, amelyek ilyen
struktúrák alkalmazására épülnek.
Mikrostruktúra-építés fotopolimerizációval
A fotopolimerizációs struktúraépítés fényre keményedő műanyagok
alkalmazásán alapul. Egy folyadék halmazállapotú műanyagból indulunk
ki, amely fénygerjesztés hatására polimerizálódik, megkeményedik. A
struktúra építésének tehát az a folyamata, hogy megfelelő helyeken
megvilágítjuk az anyagot, ott az megkeményedik, kialakul a kívánt
alakzat, ezt követően a maradék folyadékot eltávolítjuk (előhívjuk a
testet). Ilyen eljárással egyébként nagy testek is készíthetők, ipari
termékek modelljeit, akár sebészeti protéziseket is gyártanak így. A
mi esetünkben a kis méretek a jellemzők. A legkisebb méretek lézer
gerjesztéssel érhetők el, a fény hullámhossza a meghatározó
mérettartomány. Ha lézerfényt mikroszkópobjektívvel fókuszálunk, és
kétfotonos gerjesztést alkalmazunk, néhány száz nanométeres jellemző
méretű legkisebb térfogat alakítható ki, vagyis ez a létrehozható
szerkezetek térbeli feloldása. A legegyszerűbb eljárásban a fókuszált
lézerfényt számítógépes vezérléssel megfelelő pályán mozgatva mintegy
kirajzoljuk az elkészítendő testet (Galajda – Ormos, 2001).
Nyilvánvaló az eljárás óriási előnye: a fókusz tetszőleges pályán
mozoghat, vagyis a kialakított test alakja akármilyen bonyolult lehet.
A testek mérete jellemzően a mikrométeres tartomány, a felső határt a
kialakítás időtartama korlátozza. Kifejlesztettünk
alapvetően a gyorsítást elősegítő megvilágítási eljárásokat is:
például egyetlen fókuszált nyaláb helyett többszörözött nyalábbal
egyszerre több testet is rajzolhatunk, holografikus úton a mintát
egyetlen megvilágítással is létrehozhatjuk stb. (Kelemen et al., 2007)
Az 1. ábrán egy érdekes, meglehetősen
bonyolult, pár mikrométeres testet mutatunk be.
Speciális alakú testek
optikai mikromanipulációja
Az optikai mikromanipuláció ma már a biofizika széles körben
alkalmazott nagy teljesítményű kísérleti eljárása. Azon alapul, hogy a
mikrométeres mérettartományban a fény nyomásából eredő erő elegendően
nagy ahhoz, hogy ilyen mikroszkopikus testeket mozgasson, megragadjon.
Fókuszált lézerfény a környezeténél nagyobb optikai törésmutatójú
mikrométeres testeket a fókuszban rögzíti, mintegy csapdázza, a
jelenséget, illetve az eszközt optikai csapdának, optikai csipesznek
hívják. Az eszköz által pN nagyságú erők fejthetők ki, ez éppen a
baktériumok mozgásával, a biológiai makromolekulák működésével
kapcsolatos erők nagyságrendje – ez a szerencsés egybeesés az
alkalmazhatóság alapja.
A lézerfény és a megragadott test kölcsönhatását
természetesen befolyásolja a test alakja. A forma megfelelő
alakításával a kölcsönhatás mintegy irányítható, azaz a megfelelő
alakú testtel speciális manipulációs lehetőségeket lehet létrehozni.
Íme néhány példa: propeller alakú testek lézercsipeszben megragadva
forogni kezdenek. A forgás alapja a fénynyomás, teljesen analóg módon
a szélmalom esetével: a propellerre jutó fény a ferde lapátokról
szóródva ugyanúgy forgást kelt, mint a malom vitorláin eltérített
szél. Az ilyen fény hajtotta propellerekkel összetett, ugyancsak
fotopolimerizációs eljárással előállított mikromechanikus gépeket
lehet hajtani, egészen bonyolult mikrométeres rendszerek készíthetők
és működtethetők tehát így (Galajda – Ormos, 2001). Készítettünk
például mikrofluidikai eszközökben alkalmazható integrált optikai
motort, folyadékpumpát stb. (Kelemen et al., 2006)
E propellerek, azon túl, hogy fény hajtotta
motorokként működnek, nagyon jól szolgálhatnak biológiai rendszerek
mozgásának modellezéséhez is. Jelenleg is folyó kísérletsorozatunkban
például a hidrodinamikai szinkronizáció jelenségét tanulmányozzuk
velük (Di Leonardo et al., 2012). A biológiai mikrovilágban a mozgás
keltése gyakran csillók csapkodásával, flagellák forgásával történik.
Általában több ilyen szervecske mozog egyszerre, és a csapkodás,
forgás szinkronizáltan zajlik. Régi kérdés, mi e szinkronizáció oka.
Két alapvető lehetőség van: a szinkronizáció eredhet a mozgató
egységek összehangolt működéséből, de lehet egyszerű hidrodinamikai
oka is, mégpedig az, hogy az egymáshoz közel mozgó testek a köztük
levő folyadék által kölcsönhatásba kerülnek, és e kölcsönhatás
eredményezi az egyszerre zajló mozgást. E második lehetőséget már
korábban felvetették, meggyőző kísérleti bizonyítékot azonban eddig
nem sikerült adni. Fény hajtotta propellerjeinket alkalmaztuk a kérdés
vizsgálatára, hiszen a mozgás közben ható erők hasonlóak a valóságban
is fellépőekhez. Nagyon lényeges további jellemző a testek mérete. A
kialakított modelljeink nagysága megfelel a valóságban szinkronizálódó
testekének. A méret rendkívül fontos a mozgás jellegének
meghatározásában. A hidrodinamikai jelenségek modellezésénél az
áramlást jellemző Reynolds-szám azonossága kulcskérdés – esetünkben a
Reynolds-szám nagyon kicsi. Ugyancsak a méret a döntő a Brown-mozgás
nagyságában: a mikrovilágban zajló mozgásokban a Brown-fluktuáció
nagyon nagy összetevő. (Egyébként e két jellemző – a kis
Reynolds-szám, illetve a nagy Brown-fluktuáció – miatt a
mikroszkopikus testek mozgása folyadékokban nagyon más, mint amit
makroszkopikus világunkban tapasztalunk).
A kísérlet a következő: holografikus úton
létrehoztunk két optikai csapdát. A bonyolult optikai rendszerben
lehetőség van a csapdák valamennyi paraméterének tetszőleges
beállítására: a csapdák távolsága, a csapda erőssége szabadon
változtatható. E csapdákban megragadtunk egy-egy propellert. E
propellerek az előzőek szerint a csapdákban forogni kezdenek. A
rendszerünkben tehát a forgó testek helyzetét és forgási sebességüket
(hiszen ez arányos a csapdázó fény intenzitásával) tetszőlegesen
változtathattuk. Ha a forgó propellereket közel vittük egymáshoz és a
forgási sebességüket közel egyenlővé tettük, forgásuk
szinkronizálódott: együtt kezdtek forogni, mintha fogaskerékkel össze
lettek volna kapcsolva. Kimutattuk tehát a tiszta fizikai
kölcsönhatáson alapuló hidrodinamikai szinkronizációt. Rendszerünkben
ráadásul a meghatározó fizikai paraméterek, mint a forgó testek
alakja, mérete, távolsága, a rájuk ható forgatónyomatékok nagysága
stb., szabadon változtatható, a kölcsönhatás részletes fizikai
jellemzését meg lehet tenni. A jelenség teljes megértését az jelenti,
hogy létrehozunk egy fizikai modellt, amely pontosan leírja a
megfigyelt folyamatokat. A modell ellenőrzéséhez szükség van a
paraméterek változtatására, így a modell alapján meghatározhatók a
fizikai jellemzők, mint a kölcsönhatás potenciálja stb. Kísérleti
rendszerünkkel kimerítően jellemezni tudtuk a folyamatokat. Ezáltal a
modell részleteiben tesztelhető, a jelenségkör szinte tetszőleges
részletességgel tanulmányozható. Azon túl, hogy az alapjelenséget
igazoltuk, azaz, hogy a biológiai rendszertől független hidrodinamikai
kölcsönhatások képesek a megfigyelt szinkronizáció létrehozására,
lehetőségünk nyílik a nagyon érdekes hatás további tanulmányozására. A
mikrovilágban zajló áramlási folyamatok sokféle nem várt, meglepő
viselkedést produkálnak, és ezek megértése természetesen nagyon fontos
a biológiai mikrovilág megismeréséhez is.
Bemutatjuk a sajátos alakú testek optikai
manipulációjának egy másik, általunk kidolgozott változatát is. Ha az
optikai csipeszben lineárisan polarizált fényt alkalmazunk, és a
csapdázott test lapos, a csapdázás során a test orientálódik. Az
orientáció iránya olyan, hogy a test lapos felülete a polarizáció
síkjába kerül (Galajda – Ormos, 2003). E hatás nyilvánvalóan növeli az
optikai manipuláció lehetőségeit, hiszen a céltest helyzetének teljes
meghatározására nyílik így mód. Tekintve, hogy a mikroszkopikus
biológiai objektumok (baktériumok, sejtorganellumok, kromoszómák stb.)
általában nem gömb alakúak, ezért ezzel az eljárással pontosan
orientálni tudjuk őket, ez számos vizsgálat során előnyös lehet (Garab
et al., 2005). További fontos új lehetőség, hogy e hatás alapján a
megragadott testeken forgatónyomatékot tudunk mérni, illetve
forgatónyomatékot tudunk kifejteni. Ha ugyanis az orientált testet egy
rá ható forgatónyomaték az egyensúlyi helyzetéből kitéríti, a csapda
visszatérítő forgatónyomatékot fog kifejteni – kis kitéréseknél e
visszatérítő nyomaték arányos a kitéréssel. Így tehát
forgatónyomatékot tudunk kifejteni egyszerűen úgy, hogy az orientáló
fény polarizációs síkját elfordítjuk. Hasonlóképpen, meg is tudjuk
mérni a testre ható forgatónyomatékot, hiszen ha ismerjük a fény
polarizációjának irányát (ezt mi állítjuk be), valamint megmérjük a
csapdázott lapos test orientációjának az irányát, a kettő
különbségéből azonnal adódik a testre ható forgatónyomaték. Mondhatni,
létrehoztunk egy mikroszkopikus nyomatékkulcsot, hiszen a működés
teljesen analóg például az autószerelésben használt eszközzel.
Természetesen az alkalmazáshoz szükség van a nyomatékkulcs
kalibrálására, azaz ismernünk kell, hogy adott szögelfordulás mekkora
nyomatéknak felel meg. Ráadásul ezt a kalibrációt minden mérés esetén
el kell végezni, hiszen értéke nagyon függ a test pontos alakjától,
valamint a csapda paramétereitől. Szerencsére ezt meg lehet tenni, a
Brown-fluktuáció ad rá aránylag egyszerű lehetőséget: a fluktuáció
nagysága egyértelműen függ a csapda orientációs rugóállandójától, és a
meghatározásához szükséges fizikai paraméterek megmérhetők minden
egyes kísérletben.
|
|
A jelenség jellemző alkalmazásaként meghatároztuk
egyetlen kettős szálú DNS-molekula torziós rugalmasságát. A hélix
alakú DNS-molekula esetében a csavarodás nyilvánvalóan nagyon fontos
deformáció: a DNS szinte minden kölcsönhatása (a benne tárolt
információ kiolvasása, a kromoszómák összeállítása, a hibák kijavítása
stb.) a molekula csavarodásával jár együtt. Ezért azután a molekuláris
események megértéséhez a torziós tulajdonságok ismerete
elengedhetetlen. Próbálták is régóta meghatározni a jellemző
értékeket, korábban azonban csak közvetett kísérletekre volt
lehetőség, és a fizikai paramétereket meglehetősen bonyolult,
részleteiben nem alátámasztott modellek segítségével lehetett
meghatározni.
Kísérleteinkben hosszú l DNS-molekulákat
használtunk. Egyik végüket mikroszkóp tárgylemezéhez rögzítettük, a
másikra pedig néhány mikrométer átmérőjű lapos korongokat
ragasztottunk. Ezeket ragadtuk meg a lineárisan poláros fénnyel
képzett optikai csipeszben. A csipesszel kifeszítettük a
DNS-molekulát, és a csapda polarizációs síkjának változtatásával
tetszőlegesen „csavargathattuk” is. A kísérletben tehát mind a
feszítési erő, mind pedig a csavarodás szabadon változtatható.
Egyúttal (hiszen a fény polarizációjának iránya és a lapos korong
helyzete is pontosan meghatározható) a DNS-molekulára ható csavaró
forgatónyomaték is mérhető. Így tehát meg tudtuk mérni, hogy ismert
forgatónyomaték mekkora elcsavarodást okoz a DNS-molekulán – ráadásul
különböző kifeszítések esetén. Végeredményben tehát egyetlen molekulán
közvetlen méréssel határoztuk meg e fontos fizikai paramétert. A
módszer új lehetőségeket nyújt a biológiai makromolekulák egyenkénti
tanulmányozására – forgatást igénylő vizsgálati eljárásban, illetve
forgással járó jelenségek jellemzésében eddig nem elérhető
megközelítés válik lehetségessé.
Integrált optikai eszközök
A fotopolimerizációs struktúraépítési eljárás sokoldalúságát
illusztrálja egy további, meglehetősen eltérő kutatási területünk. A
módszerrel integrált optikai eszközök is építhetők, sokféle biofizikai
alkalmazással. A fényvezetők a modern integrált optika
kulcskomponensei. Az eszköz központi eleme egy, a környezeténél
nagyobb optikai törésmutatójú vezető közeg. Ismeretes, hogy ha a fény
belülről nagyobb törésmutatójú közeg határára érkezik, teljes
visszaverődés történik, amennyiben megfelelő irányban (a teljes
visszaverődés határszögénél nagyobb szögben) érkezett oda. Így azután
a megfelelő irányú fény a nagyobb törésmutatójú közegben marad. Ez az
alapja annak, hogy a fényvezetőkben úgy vezethető a fény, mint
elektronok a huzalokban. A fényvezetők szerkezete tehát a következő:
nagy törésmutatójú vezető mag kisebb törésmutatójú köpennyel
körülvéve. Lehetnek szál alakúak (ez a közismert optikai szál), de
bonyolult struktúrák részeit is képezhetik. A fotopolimerizációs
fényvezető készítés alapja, hogy vannak olyan fényre keményedő
műanyagok, amelyek átlátszóak, és törésmutatójuk is megfelelő a célra.
Mi üvegfelületen építünk fényvezetőket olyan polimerekből, amelyeknek
az optikai törésmutatója tehát nagyobb az üvegénél. A készítés
folyamata a következő: az üvegfelületre felviszünk egy folyadék
halmazállapotú gyantaréteget, majd fókuszált lézergerjesztéssel
„belerajzoljuk” a kialakítandó alakzatot. A nem megkeményedett
folyadék leoldásával kialakul a végleges eszköz. Tetszőleges
kétdimenziós fényvezető hálózat, „optikai integrált áramkör” építhető
az eljárással. Illusztráló felhasználásként a
Mach–Zehnder-interferométer készítését és alkalmazását mutatjuk most
be. A Mach–Zehnder-interferométer sokoldalú optikai eszköz:
működésének alapja, hogy az interferométerbe jutó fényt kettéosztjuk,
majd bizonyos távolság után újra egyesítjük. Az újraegyesítéskor a két
fény interferenciát szenved. Attól függően, hogy a szétválasztott
szakaszon az optikai úthosszak mennyire különbözőek, a két fény
különböző fázisban fog találkozni, ez pedig az interferenciát
befolyásolja – gyengíteni, vagy erősíteni fogják egymást. Ezzel az
eszközzel nagyon érzékenyen lehet mérni az optikai úthossz
megváltozását.
Az általunk használt megoldás részletezése előtt a
fényvezetőben vezetett fény jellegzetességét kell áttekintenünk. A
teljes visszaverődésnek sajátos tulajdonsága, hogy visszaverődéskor a
fény kissé kijut a kisebb törésmutatójú közegbe is, ennek mértéke
összemérhető a fény hullámhosszával. Ezt a kis törésmutatójú közegbe
átnyúló fényt evaneszcens fénynek hívják. A fényvezető magját
körülvevő anyag ezek szerint hatással lesz a vezetett fény terjedésére
is. Ezt az evaneszcens jelleget használjuk ki az integrált optikai
Mach–Zehnder-interferométer használatakor. Az alkalmazásokban anyagok
törésmutató változásait mérjük nagy érzékenységgel.
Az eszköz kulcsa a kettéosztott fény, amint a fényvezetőben halad. A
vizsgálandó anyagot az egyik ág felületére visszük. Ha az anyag
törésmutatója megváltozik, megváltozik az ágban az optikai úthossz is,
módosul az interferencia, és ez a kimeneten a fény intenzitásának a
változásában nyilvánul meg. Az eszköz kivitelét a
2. ábrán mutatjuk be.
A törésmutató megváltozásán alapuló alkalmazások
között magától értetődik a szenzorika. Az eszköz aktív felülete az
interferométer oldalágának fényvezetője. Ha például ennek a felületét
beborítjuk egy szelektív anyaggal, annak kölcsönhatása akár egyetlen
molekulával is detektálható lesz a felület törésmutatójának
megváltozásán keresztül. Ily módon többek között antigén–antitest
kölcsönhatások vizsgálhatók kvantitatív módon, amint azt
kísérleteinkben megvalósítottuk (Dér et al., 2010). Kiemelendő, hogy
ebben az eljárásban mindenféle jelölőanyag nélkül érhető el a
nagyérzékenységű detektálás, ellentétben például a jelenleg standard
eljárásnak számító ELISA-módszerrel. Az eljárás igen egyszerűen
használható, nagyon nagy érzékenységű szenzorokat eredményez. Ráadásul
a technika könnyen kombinálható a mikrofluidikával, vagyis a modern
diagnosztika számos területén ígér hatásos alkalmazást.
Ugyanezzel az elrendezéssel optoelektronikai
logikai elemek is készíthetők. Láttuk, az eszköz úgy működik, hogy a
kimenet szabályozható a szabályozó felület törésmutatójának a
változásával. Ha tehát megfelelően irányítható törésmutatójú anyaggal
rendelkezünk, az interferométer aktív optikai elemként, optikai
kapcsolóként tud működni. Nagy tapasztalattal rendelkezünk megfelelő
tulajdonságokkal rendelkező biológiai anyaggal: a bakteriorodopszin
kromoprotein kiváló anyag ilyen alkalmazásra. A bakteriorodopszin
membránfehérje, fény hajtotta transzmembrán protonpumpa. Biológiai
funkciója a fényenergia átalakítása a membrán két oldala közti
protonkoncentráció-különbség elektrokémiai energiájává – ezt később a
baktérium hasznosítja különféle energiaigényes életfolyamataiban. A
biológiai szereptől teljesen függetlenül érdekes tulajdonsága a
bakteriorodopszinnak, hogy fénygerjesztést követően nagyon megváltozik
a színe. E színváltozás természetesen az optikai törésmutató
változásával jár együtt. Ezért ha a Mach–Zehnder-interferométer aktív
felületét bakteriorodopszinnal vonjuk be, az eszköz fényáteresztő
képességét a bakteriorodopszin felület megvilágításával a
törésmutató-változáson keresztül modulálni tudjuk. Kialakítottunk egy
fénnyel vezérelt fénykapcsolót; ez a jövő optikai adatfeldolgozó
eszközeinek fontos komponensévé válhat (Dér et al., 2007). Ráadásul a
kapcsolás sebessége nagyon nagy lehet. A bakteriorodopszin
fotoreakciói nagyon gyorsak: a gerjesztést követő leggyorsabb
színváltozási reakció pikoszekundumnál is rövidebb idő alatt lezajlik,
vagyis akár ilyen sebességű optikai kapcsolás is lehetséges az
eszközzel, ezt a közelmúltban megvalósítottuk (Fábián et al., 2011).
Ez jelentősen meghaladja az elektronikus adattovábbításban jelenleg
használatos kapcsolók sebességét.
Remélem, a példák meggyőzően illusztrálták a
fotopolimerizált mikrostruktúrák alkalmazásának érdekes lehetőségeit.
Kulcsszavak: fotopolimerizáció, biológiai mozgás, optikai
manipuláció, biofotonika
IRODALOM
Dér András – Valkai S. – Mathesz A. – Ando
I. – Wolff, E. K. – Ormos P. (2010): Protein-Based All-Optical Sensor
Device. Sensors And Actuators B-Chemical. 151, 1, 26–9. •
WEBCÍM >
Dér András – Valkai S. – Fábián L. – Ormos
P. – Ramsden, J. J. – Wolff, E. K. (2007): Integrated Optical
Switching Based on the Protein Bacteriorhodopsin. Photochemistry and
Photobiology. 83, 2, 393–396. DOI: 10.1562/2006-06-21-RA-944
Fábián L. – Heiner, Z. – Mero, M. – Kiss
M. – Wolff, E. K. – Ormos P. – Osvay K. – Dér A. (2011): Protein-Based
Ultrafast Photonic Switching. Optics Express. 19, 18861–18870. •
WEBCÍM >
•
WEBCÍM >
Galajda Péter – Ormos Pál (2001): Complex Micromachines Produced and
Driven by Light. Applied Physics Letters. 78, 249–251. •
WEBCÍM >
Galajda Péter – Ormos Pál
(2003): Orientation of Flat Particles in Optical Tweezers by Linearly
Polarized Light. Optics Express. 11, 446–451. •
WEBCÍM >
Garab Győző – Galajda P. – Pomozi I. –
Finzi L. – Praznovsky T. – Ormos P. – Van Amerongen, H. (2005):
Alignment of Biological Microparticles by Polarized Laser Beam.
European Biophysics Journal. 34, 335–343.
DOI: 10.1007/s00249-004-0454-8
Kelemen Lóránd – Valkai S. – Ormos P.
(2006): Integrated Optical Motor. Applied Optics. 45, 2277–80. •
WEBCÍM >
Kelemen Lóránd – Valkai S. – Ormos P.
(2007): Parallel Photopolymerisation with Complex Light Patterns
Generated by Diffractive Optical Elements. Optics Express.
14488–14497. •
WEBCÍM >
Di Leonardo, Roberto – Búzás A. – Kelemen
L. – Vizsnyiczai G. – Oroszi L. – Ormos P. (2012): Hydrodynamic
Synchronization of Light Driven Microrotors. Physical Review Letters.
109, 034104
Oroszi László – Galajda P. – Kirei H. –
Bottka S. – Ormos P. (2006): Direct Measurement of Torque in the
Optical Trap and Its Application to
Double-Strand DNA. Physical Review
Letters. 97. 058301. DOI: 10.1103/PhysRevLett.97.058301
|
|