Összefoglalás

Az élő szervezetekben elsősorban fehérjékből felépülő molekuláris gépezetek működnek, amelyek rendelkeznek az önszerveződés képességével. Ilyenek például a baktériumok mozgásszervei, a flagellumok is, amelyek sejtmembránba ágyazott része magában foglal egy 50 nm átmérőjű nanomotort, ami a hozzá kapcsolódó helikális filamentumot propellerként forgatva hajtja előre a baktériumot. Az önszerveződő szupramolekuláris rendszerek tulajdonságainak megértése technológiai szempontból is fontos feladat, hiszen segítségünkre lehet saját molekuláris gépezeteink kifejlesztésében.

Bevezetés

A baktériumok flagellumok segítségével úsznak. A sejtek felszínéről kiinduló hosszú helikális filamentumok a sejtmembránban elhelyezkedő, fehérjekomponensekből felépülő molekuláris motorokhoz kapcsolódnak (1. ábra), amelyek akár százezres percenkénti fordulatszám elérésére is képesek. A flagelláris motorok morfológiájukat tekintve nagyon hasonlítanak az ember által készített elektromotorokhoz, hengerszimmetrikus szerkezetűek, álló- és forgórészből állnak, de nem elektronok, hanem protonok hajtják őket. A propellerként funkcionáló helikális filamentumok a flagellin fehérje több tízezer kópiájából épülnek fel, s hosszúságuk akár a 20 mikrométert is elérheti. A motor tengelyét a külső filamentumokkal az erősen görbült szerkezetű kampó köti össze. A kampót mintegy 130 azonos fehérjealegység alkotja. A kampó nemcsak passzív összekötő elem a motor és a filamentumok között, hanem egyfajta kardáncsuklóként működve olyan erőátviteli szerkezetként funkcionál, amely képes a forgástengely irányának megváltoztatására. A helikális köteggé összeállt filamentumok ugyanis nem a motor tengelye körül, hanem arra közel merőleges irányban elhelyezkedve saját hossztengelyük körül forognak. Bár a flagellin és a kampó fehérje a flagellumok filamentáris részének fő alkotórészei, a filamentum szerkezetének kialakításában fontos szerepet játszanak még a HAP-fehérjék. A HAP1- és HAP3-fehérjék néhány példánya egy vékony kapcsolózónát alakít ki a kampó és a helikális filamentumok között, míg a HAP2-fehérje a filamentumok végét lezáró molekuláris sapka felépítésében játszik szerepet. Morfológiai szempontból a bakteriális flagellumok – elsősorban a motor felépítésében részt vevő – gyűrű alakú képződményekből és egy, a motor tengelyét, a kampót és a helikális filamentumokat magában foglaló axiális struktúrából állnak. A motor tengelyét felépítő négyféle rod fehérjét, a kampó fehérjét, a flagellint, és a HAP-fehérjéket együttesen axiális fehérjéknek nevezik.

A flagelláris motorok kétségtelenül a bakteriális flagellumok legérdekesebb részei, de membránba ágyazott struktúrákról lévén szó, tanulmányozásuk rendkívül nehéz feladat. A flagelláris motorok mellett azonban a helikális filamentumok szerkezete is számos érdekességgel szolgál. A flagelláris filamentumok talán legizgalmasabb tulajdonsága önszerveződő képességük, ami azt jelenti, hogy megfelelő körükmények között a flagellin monomerek spontán módon képesek összeállni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká. Ez korántsem magától értetődő jelenség, mert a flagelláris filamentumok olyan szuperhelikális képződmények, amelyekben az egyes alegységek egymástól eltérő lokális környezetben találhatók. A kristálynövekedéstől eltérően itt olyan spontán önszerveződés történik tehát, amelynek során azonos alegységek egymástól eltérő konformációban vesznek részt a létrejövő szerkezet kialakításában. A képződött filamentumok másik figyelemre méltó sajátossága az, hogy a környezeti körülményektől függően, reverzibilis módon, különféle helikális formákba képesek átrendeződni. Ezt a jelenséget polimorfizmusnak nevezik. Ilyen helikális szerkezeti átrendeződések előidézhetők a hőmérséklet, ionerősség vagy pH változtatásával, de mechnikai erőhatás is kiválthatja őket.

Önszerveződő képesség
és szerkezeti rendezetlenség

A bakteriális flagelláris filamentumok önszerveződő szupramolekuláris rendszerek. Az önszerveződő, a környezeti változásokra aktívan reagálni képes makromolekuláris rendszerek tulajdonságainak megértése technológiai szempontból is alapvető fontosságúnak tűnik. Kutatásaink során igyekeztünk kideríteni, hogy melyek azok a szerkezeti sajátosságok, amelyek a flagelláris fehérjék önszerveződő képességének hátterében állnak.

A flagellin alegységek a flagelláris filamentumok fő alkotóelemei. A flagellin polimerizációs tulajdonságait vizsgálva többen felfigyeltek arra, hogy a filamentáris szerkezet kialakulása során a molekula nagymértékű konformációs átrendeződésen megy keresztül, de ennek szerkezeti háttere hosszú időn át homályban maradt. Limitált proteolízis, kalorimetriás és NMR spektroszkópiás vizsgálatok segítségével kimutattuk, hogy a flagellin esetében a nagyjából első 70, illetve utolsó 40 aminosavnyi részt magukban foglaló terminális régiók monomer állapotban rendezetlenek (Vonderviszt et al., 1989), míg a polipeptidlánc középső része három jól definált térszerkezetű globuláris egységet (domént) alkot. Későbbi vizsgálataink azt mutatták, hogy nemcsak a flagellin, de valamennyi axiális fehérje terminális régiói rendezetlenek, azaz a rendezetlen terminális régiók léte az axiális fehérjék általános szerkezeti sajátossága (Vonderviszt et al., 1992). Ugyanakkor a rendezetlen terminális régiók ezen fehérjék legkonzervatívabb részét képezik. Bioinformatikai predikciós módszerek azt jelezték, hogy az axiális fehérjék rendezetlen terminális régiói erős α-hélix-képző potenciállal rendelkeznek. Megmutattuk, hogy a polimerizációs folyamat során a terminális régiók egymással kölcsönhatásba lépve helikális kötegeket alkotva rendeződnek. Röntgen-száldiffrakciós és alacsonyhőmérsékletű elektronmikroszkópiás szerkezetanalízis kombinált alkalmazásával felderítettük (Samatey et al., 2001), hogy ezek a helikális kötegek meghatározó szerepet játszanak a filamentumok belső magjának kialakításában.

Mi indokolja a rendezetlen terminális régiók nagyfokú konzerválódottságát? A rendezetlen terminális régiók kiemelkedő fontossága az axiális fehérjék önszerveződő képességének szabályozásában rejlik. Az axiális fehérjék a citoplazmában szintetizálódnak, majd egy speciális exportmechanizmus segítségével a flagelláris filamentumok belsejében található csatornán át jutnak el beépülési helyükre, a filamentumok végére. Létfontosságú a baktérium számára, hogy a nagy mennyiségben szintetizálódott axiális fehérjék ne polimerizálódjanak a sejten belül, hanem csak a megfelelő helyen, a filamentumok végén. A rendezetlen terminális régiók akadályozzák meg, hogy a viszonylag nagy mennyiségben szintetizálódó axiális fehérjék már a citoplazmában polimerizálódni kezdjenek. Az alegységek rendezetlen régiói oldatban nem képesek hatékonyan egymáshoz kapcsolódni, nem képesek egymást stabilizálni, ezért a citoplazmában nem indul meg a filamentumképződés. Csak egy jól definiált kötőfelület képes a rendezetlen régiók stabilizálására. Ez a mechanizmus biztosítja, hogy a polimerizáció csak a megfelelő helyen, a filamentumok végén történhet meg, hiszen ott már beépült és szerkezetileg rendeződött alegységek találhatók, amelyek egy stabil kötőfelszínt képeznek, ami templátként funkcionálva képes stabilizálni az újonnan érkező alegységek rendezetlen régióit. Ezért a filamentumok végén a polimerizáció könnyedén végbemegy. A polimerizáció hatékonyságát tovább fokozza a filamentumok végét lezáró HAP2 molekuláris sapka hatása is, ami nem engedi kidiffundálni a flagellin alegységeket, s az alatta található üregben rendkívül magas lokális monomerkoncentrációt eredményez.

A terminális régiók rendezetlensége a polimerizációs képesség szabályozásán túl egyéb előnyökkel is jár. Lehetővé teszi, hogy ezen szegmensek révén az axiális fehérjék több különböző partnerrel is legyenek képesek összekapcsolódni. Például a flagellin nemcsak másik flagellin alegységekhez kapcsolódik a filamentáris szerkezete kialakulása során, de a filamentum tövénél a HAP3-fehérjékhez is képes kötődni, míg a sejttől távoli végen a HAP2-alegységekkel alakít ki kapcsolatot. A rendelkezésre álló szerkezeti információk szerint ezekben a kölcsönhatásokban ugyanazon terminális szegmensek játszanak fontos szerepet. A rendezetlen régiók más-más kötőfelszíneken eltérő módon rendeződve sokoldalú kötődésre képesek.
In vivo filamentumképződés:

a HAP2 molekuláris sapka
és a flagelláris exportrendszer

A flagelláris filamentumok in vivo szerkezetkiala-kulása csak a HAP2-fehérjekomplexum jelenlétében megy végbe. A flagelláris filamentumok végét a HAP2-fehérje néhány példányából álló sapkaszerű képződmény zárja le (1. ábra). Ez a sapka teszi lehetővé, hogy a citoplazmából a filamentumok belsejében lévő csatornán át transzportálódó flagellin alegységek beépülhessenek a filamentumok végére, s ne diffundáljanak a közegben szerteszét. A HAP2-sapka „intelligens” kötődésre képes, és látszólag ellentmondásos tulajdonságokkal rendelkezik. Egyfelől, nagyon erősen kötődik a filamentumok végéhez, gyakorlatilag sohasem válik le onnan. Másfelől azonban képesnek kell lennie arra is, hogy alkalmas pillanatban lokálisan elengedve a filamentumok végét, lehetővé tegye az újonnan érkező flagellin alegységek beépülését. Másodpercenként kb. tíz alegység képes a sapka alá beépülni, s a képződő filamentumok hossza akár a 20 µm-t is elérheti.

A HAP2-fehérje – a többi axiális fehérjéhez hasonlóan – monomer állapotban kiterjedt rendezetlen terminális régiókkal rendelkezik, amelyek erős hélixképző potenciállal jellemezhetők. Noha a HAP2-fehérje in vitro önszerveződése során szobahőmérsékleten két azonos pentamer egységből álló, dekamer szerkezeteket alkot, vizsgálataink megmutatták, hogy a flagelláris filamentumok végét lezáró HAP2-sapka valójában pentamer szerkezetű, amelyet az alegységek kompakt, centrális részei közötti hidrofób kölcsönhatások tartanak össze (Vonderviszt et al., 1998). A HAP2-pentamer mintegy dugóként illeszkedik bele a filamentumok végén található üregbe, és az alegységeik helikálisköteg-képzésre hajlamos, rendezetlen terminális régióin keresztül lép kölcsönhatásba a filamentumok végével.

In vitro rekonstruált filamentumsapka komplexumok alacsony hőmérsékletű elektronmikroszkópiás egyrészecskés analízisével meghatároztuk a filamentumok végét lezáró HAP2-komplexum szerkezetét (Yonekura et al., 2000). A kapott elektronsűrűség-diagramok egyértelműen mutatják, hogy a funkcionális HAP2-pentamert alkotó egyes alegységek aszimmetrikus módon, egymástól eltérő konformációban, a terminális régiókat tartalmazó flexibilis láb-doménjeiken keresztül kötődnek a filamentumok végéhez. Mindez a sapka és a filamentum vége között egyetlen helyen egy nagyobb üreg megjelenését eredményezi, ahol megtörténhet a filamentumok belső csatornáján keresztül exportálódó flagellin alegységek feltekeredése és a filamentumok végére való beépülése.

A rendelkezésre álló kísérleti eredményekre alapozva modellt dolgoztunk ki a HAP2-sapka működésének molekuláris mechanizmusára nézve, amely magyarázatot nyújt arra, hogy a HAP2-komplexum miként képes a filamentumok végéhez erősen kötődőve mégiscsak lehetővé tenni, hogy a centrális csatornán át a citoplazmából érkező flagellin alegységek alája beépülhessenek (Vonderviszt et al., 1998). Elképzeléseink szerint a HAP2-sapka működésében a sapka és a filamentum nemkompatibilis szimmetriája és az alegységek rendezetlen terminális régióiban a kötődés során bekövetkező, rendezetlen–rendezett állapotok közötti szerkezeti átmenetek játszanak meghatározó szerepet.

A bakteriális flagellumok axiális fehérjéi egy speciális exportapparátus segítségével, a filamentumok centrális csatornáján keresztül jutnak el beépülési helyükre, a filamentumok végére (Minamino et al., 2008). A flagellumok tövénél a citoplazma felőli oldalon található exportrendszer képes felismerni az exportálandó flagelláris fehérjéket, és energiaforrásként a belső membrán két oldala közötti protonkoncentráció-különbséget kihasználva kitekeredett formában bejuttatni őket a filamentumok belső csatornájába. Mindezidáig nem ismert, hogy mi az a jel, szerkezeti vagy szekvenciális sajátosság, amelynek alapján a flagellumspecifikus exportapparátus felismeri az exportálandó fehérjéket. Szekvenciális szinten semmiféle olyan, az axiális fehérjék mindegyikében fellelhető közös sajátosságot sem sikerült kimutatni, amely az exportapparátus számára azonosító jelként szolgálhatna. Nincs lehasításra kerülő szignálpeptid, sem közös szignálszekvencia. Mindez arra utal, hogy az exportapparátus által felismert közös sajátosság valamilyen magasabb szerkezeti szinten keresendő.

Különféle génsebészetileg előállított, N-terminális régiójukban csonkított variánsok exportképességének vizsgálata révén sikerült lokalizálnunk a flagellin exportszignálját (Végh et al., 2006; Gál et al., 2006). Megállapítottuk, hogy a flagellin aminosavszekvenciájának 26-47 szegmense hordozza a felismerési jelet az exportapparátus számára. Ez az erősen konzerválódott részlet a flagellin rendezetlen N-terminális régiójában található, amely a predikciós eljárások szerint jelentős α-hélix-képző potenciállal rendelkezik. Vajon miként képes egy rendezetlen szegmens felismerési jelként funkcionálni? Hipotézisünk szerint az exportrendszer felismerő helye az exportszubsztárok azonosítását végző fehérje alegységen egy szűk vájatban található, amely csak egy kitekeredett flexibilis polipeptid szegemens befogadására képes. Az exportszignál a felismerés során alfa-helikális szerkezetbe rendeződve indítja el a transzlokáció folyamatát. Hasonló mechanizmus figyelhető meg a mitokondriális exportrendszer működése során.

A terminális régiók rendezetlensége és azok helikális stabilizálódási képessége az axiális fehérjék egyedüli közös szerkezeti sajátossága. Eddig csak néhány flagelláris fehérjénél történt meg az exportszignál lokalizálása, de azt minden esetben az N-terminális rendezetlen régió tartalmazza. Mindez a felismerési folyamat során alátámasztja a helikális rendeződés általános mechanizmusát.

Megfigyeltük, hogy ha flagellintermelésre képtelen, ezért csak a kampó részig kiépült exportcsatornát tartalmazó mutáns szalmonella-gazdasejteket használunk, akkor a flagellin exportszignálját idegen fehérjékhez kapcsolva azok hatékonyan kijuttathatók a sejtből a flagelláris exportrendszer segítségével (Dobó et al., 2010). Ez a felismerés megnyitotta az utat a flagelláris export célzott felhasználása előtt. Az idegen fehérjék génmódosított baktériumokkal történő termeltetése napjaink biotechnológiai gyakorlatának egyik fontos eljárása. Ma már számos enzimet, hatóanyagot, gyógyszeralapanyagot állítanak elő ilyen módon, azonban gyakori problémaként jelentkezik, hogy a nagy mennyiségben termeltetett fehérjetermék rendszerint oldhatatlan formában – ún. inklúziós testeket képezve – kicsapódik a baktérium belsejében. A flagelláris exportrendszer kiváló lehetőséget kínál a baktériumokban nagy mennyiségben termeltetett idegen fehérjék sejtből való hatékony kijuttatására. Az MTA Enzimológiai Intézetével közösen végzett fejlesztőmunkánk eredményeként egy olyan bakteriális expressziós rendszert hoztunk létre (Vonderviszt et al., 2012), amely a széleskörű biotechnológiai hasznosíthatóság érdekében megkönnyíti a szekretált fehérje tisztítását és működőképes formában történő előállítását. Az exportszignál és a termeltetni kívánt fehérje közé beépítettük az enterokináz enzim specifikus hasítóhelyét, továbbá a fúziós konstrukció N-terminális végére a tisztítást megkönnyítő polihisztidin toldalékot tettünk, ami gyakorlatilag egy lépésben lehetővé teszi a felülúszóból való hatékony izolálást és tisztítást. Ezt követően a fehérje megfelelő működését esetlegesen zavaró felesleges részek proteolitikus emésztéssel való szelektív eltávolítása könnyen megvalósítható. Eljárásunkra szabadalmi védettséget szereztünk.

A szekrécióval összekapcsolt fehérjeexpresszió számos előnnyel kecsegtet: nincs szükség a sejtek feltárására, ezért a tisztítandó minta egyéb fehérjékkel, nukleinsavakkal vagy lipidekkel kevéssé szennyezett. Az eljárás különösen előnyösnek tűnik olyan fehérjék esetében, amelyek a sejten belül könnyen degradálódnak, vagy oldhatatlan csapadékot képeznek. Az exportrendszer a flagelláris fehérjéket részlegesen kitekeredett formában juttatja ki a filamentumok szűk belső csatornáján keresztül. Feltehetőleg az exportszignálhoz kapcsolt fehérjék is hasonlóan exportálódnak, azonban a külső médiumban az aggregációt elkerülve jó eséllyel képesek felvenni natív működőképes térszerkezetüket.

Flagellinalapú építőelemek
filamentáris nanoszerkezetek létrehozására

A flagellin fehérje képes az önszerveződésre. Vajon miként ruházhatnánk fel más fehérjéket is az önszerveződés képességével, hogy belőlük előnyös tulajdonságokkal rendelkező filamentáris nanoszerkezeteket építhessünk. Munkánk során olyan fúziós fehérjéket kívánunk létrehozni, amelyekben különféle fehérjéket kapcsolunk össze a polimerizációra képes flagellin fehérjével, oly módon, hogy mindkét partner funkcionális tulajdonságai megmaradjanak.

Röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópiás vizsgálatok révén meghatároztuk a flagelláris filamentumok atomi felbontású térszerkezetét (2/A ábra). A flagellin alegységek erősen konzerválódott terminális régiói szorosan egymáshoz kapcsolódva vesznek részt a filamentumépítésben, a filamentumok belső magjának kialakításában, míg a polipeptidlánc variábilis középső része alkotja a filamentumok felületén elhelyezkedő D3-domént, ami a szomszédos alegységekkel nincs kontaktusban. Vizsgálataink megmutatták, hogy a D3-domén a filamentáris szerkezet megzavarása eltávolítható, átalakítható, vagy helyére idegen fehérjék beépíthetők (Muskotál et al., 2010).

A xilanáz enzimet a D3-domén helyére megfelelő összekötő szegmensek alkalmazásával beültetve a közelmúltban elkészítettük a polimerizációra képes enzimek prototípusát (2/B ábra) (Szabó et al., 2011). A flagellin-xilanáz fúziós fehérje megfelelő körülmények között képes volt filamentumokat formálni, amelyek xilánbontó katalitikus aktivitást mutattak. Hasonló módon más enzimek flagellinnel való fúziós konstrukciói is elkészíthetők. A polimerizációra képes enzimekből akár több ezer katalitikus egységet hordozó, csatolt reakciók irányítására képes multienzim nanoszerkezetek építhetők számos alkalmazási lehetőséget kínálva a biokonverziós technológiákban.

Nemrégiben sikeresen beépítettük a flagellin belsejébe a zöld fluoreszcens GFP-fehérjét is (Klein et al., 2012). A GFP-t hordozó flagellin variánsból intenzíven fluoreszkáló filamentumok építhetők. Jelenleg flagellinalapú kötőfehérjék előállításán dolgozunk, amelyek képesek célmolekulák specifikus felismerésére és megkötésére. A flagellinalapú kötőfehérjékből olyan kontrollált méretű filamentáris nanoszerkezeteket kívánunk építeni, amelyek felületükön specifikus kötőhelyek ezreit tartalmazzák, rendkívül nagy kötőhelysűrűséget és az adott célmolekula hatékony megkötését eredményezve. Filamentáris receptorainkat bioszenzorok felületére rögzítve specifikus molekulafelismerési tualjdonságokkal rendelkező fehérjeréteget hozhatunk létre. Az MTA TTK MFA Nanoszenzorikai Laboratóriumával együttműködésben ilyen érzékelő réteget alkalmazó, nagy érzékenységű hullámvezető optikai módszerek kifejlesztésén dolgozunk, amelyek reményeink szerint széles körűen alkalmazhatóak lesznek a környezeti monitorozásban, az élelmiszerbiztonsági vizsgálatokban, valamint az orvosi diagnosztikában.
 

Kulcsszavak: bakteriális flagellum, flagellin, önszerveződés, flagelláris export, bakteriális fehérjetermelés, filamentáris nanoszerkezet
 

IRODALOM

Dobó József – Varga J. – Sajó R. et al. (2010): Application of a Short, Disordered N-Terminal Flagellin Segment, a Fully Functional Flagellar Type III Export Signal, to Expression of Secreted Proteins. Applied Environmental Microbiology. 76, 891–899. DOI: 10.1128/​AEM.00858-09 • WEBCÍM >

Gál Péter – Végh B. M. – Závodszky P. – Vonderviszt F. (2006): Export Signals. Nature Biotechn. 24, 900–1. • WEBCÍM >

Klein Ágnes – Tóth B. – Jankovics H. et al. (2012): A Polymerizable GFP Variant. Protein Engineering Design and Selection. DOI: 10.1093/Protein/Gzs003.

Minamino, Tohru – Imada, K. – Namba, K. (2008): Mechanisms of Type III Protein Export for Bacterial Flagellar Assembly. Molecular Biosystems. 4, 1105–1115. DOI: 10.1039/B808065H

Muskotál Adél – Seregélyes Cs. – Sebestyén A. – Vonderviszt F. (2010): Structural Basis for Stabilization of the Hypervariable D3 Domain of Salmonella Flagellin upon Filament Formation. Journal of Molecular Biology. 403, 607–615. • WEBCÍM >

Samatey, Fadel A. – Imada, K. – Nagashima, S. et al. (2001): Structure of the Bacterial Flagellar Protofilament and Implications for a Switch for Supercoiling. Nature. 410, 331–337. DOI:10.1038/35066677

Szabó Veronika – Muskotál A. – Tóth B. et al. (2011): Construction of a Xylanase a Variant Capable of Polymerization. PLOS ONE. 6, E25388.

Végh Barbara M. – Gál P. – Dobó J. et al. (2006): Localization of the Flagellum-Specific Secretion Signal in Salmonella Flagellin. Biochemical Biophysical Research Communications. 345, 93–98. • WEBCÍM >

Vonderviszt Ferenc – Kanto, S. – Aizawa, S. I. et al. (1989): Terminal Regions of Flagellin Are Disordered in Solution. Journal of Molecular Biology. 209, 127–133. • WEBCÍM >

Vonderviszt Ferenc – Ishima, R. – Akasaka, K. et al. (1992): Terminal Disorder: a Common Structural Feature of the Axial Proteins of Bacterial Flagellum. Journal of Molecular Biology. 226, 575–579. • WEBCÍM >

Vonderviszt Ferenc – Imada, K. – Furukawa, Y. et al. (1998): Mechanism of Self-Association and Filament Capping by Flagellar HAP2. Journal of Molecular Biology. 284, 1399–1416. • WEBCÍM >

Vonderviszt Ferenc – Sajó R – Dobó J. – Závodszky P. (2012): The Use of a Flagellar Export Signal for the Secretion of Recombinant Proteins in Salmonella. Methods in Molecular Biology. 824, 134–143. DOI: 10.1007/978-1-61779-433-9_6

Yonekura, Koji – Maki, S. – Morgan, D. G. et al. (2000): The Bacterial Flagellar Cap as the Rotary Promoter of Flagellin Self-Assembly. Science. 290, 2148–2152. DOI: 10.1126/science.290.5499.2148