A Magyar Tudományos Akadémia folyóirata. Alapítva: 1840
 

KEZDŐLAP    ARCHÍVUM    IMPRESSZUM    KERESÉS


 MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK SZEREPE MORFOLÓGIAILAG KÖZELÁLLÓ

    ENCHYTRAEIDA (ENCHYTRAEIDAE, ANNELIDA) FAJOK TAXONÓMIAI

    PROBLÉMÁINAK MEOGLDÁSÁBAN

X

Dózsa-Farkas Klára

az MTA doktora, ELTE Állatrendszertani és Ökológiai Tanszék • kdozsafarkas(kukac)gmail.com

Boros Gergely

a PhD, MTA Ökológiai Kutatóközpont Ökológiai és Botanikai Kutatóintézet, Vácrátót • henlea(kukac)gmail.com

Felföldi Tamás

PhD, ELTE Mikrobiológiai Tanszék • tamas.felfoldi(kukac)gmail.com

Cech Gábor

a PhD, MTA Agrártudományi Kutatóközpont Állatorvos-tudományi Intézet Halkórtani és Parazitológiai Témacsoport
cech(kukac)freemail.hu

 

 

Bevezetés


Az Enchytraeidae család (televényférgek) a gyűrűsférgek (Annelida) törzsébe tartozó kisebb testű (0,2 mm – 2–3 cm nagyságú), többnyire fehéres színű férgeket foglal magába. Kivételesen ismerünk 10–17 cm hosszú (például: Mesenchytraeus grandis, Eisen 1904, M. anteeus Rota & Brinkhurst, 2000) és pigmentált (M. franciscanus Eisen, 1904, M. melanocephalus Christensen & Dózsa-Farkas, 1999), akár fekete színű M. solifugus (Emery, 1898) fajokat is Alaszkából. Jelentőségük szaprofág voltuk mellett abban van, hogy gyakran igen magas egyedszámban találhatók (maximális egyedszámuk elérheti a 300 000 egyed/m2-t is), minden földrészen és szinte minden élettérben élnek a trópusoktól a sarkkörökig, a tengerektől a gleccserek borította magas hegyekig. A család harminc génuszának 690 elfogadott faja van, de ez a szám folyton növekszik.

Taxonómiájukban, rendszerezésükben, rokonsági viszonyaik feltárásában, mint majdnem minden állatcsoportban, napjainkban előtérbe kerültek a molekuláris biológiai vizsgálatok. Ennek oka, hogy ily módon feltárhatjuk az Enchytraeidae család génuszainak és fajainak egymáshoz való, valamint a többi gyűrűsféreghez viszonyított filogenetikai kapcsolatát. Cél továbbá annak felmérése, hogy a fajok morfológiai bélyegeinek variálódása mennyire intraspecifikus vagy interspecifikus jellemzőként használható a fajok elkülönítésében, továbbá szinonimákat állapíthatunk meg, fajkomplexeket szüntethetünk meg, valamint kriptikus speciációk felfedése válik lehetővé.

Az Enchytraeidae családban az első molekuláris vizsgálatok enzimpolimorfizmusra irányultak (Christensenet al., 1976). Hasonló eredményeket ért el Volker Brockmeyer (1991), illetve Rüdiger M. Schmelz és munkatársai (2000), akik izozimek elkülönítése révén közel rokon Enchytraeus fajokat választottak szét. Schmelz (2003) a Fridericia génuszt felölelő monografikus munkájában 34 fajra végzett teljes protein- és három enzim (észteráz, foszfoglükomutáz és malát-dehidrogenáz) vizsgálatot. Jelentős heterogenitást sikerült kimutatnia egyes taxonómiailag problémás fajok esetében. Bent Christensen és Henrik Glenner (2010) molekuláris filogenetikai problémákra 4977 bázispár lefedéssel nukleáris- és mitokondriális gének analízisét vetette egybe bizonyos morfológiai bélyegekkel. Ezáltal érdekes új rokonsági kapcsolatokat tudott kimutatni egyes génuszok között.

Talán a legjelentősebbek a Christer Erséus és munkatársai 2010-ben közölt munkájában közzétett eredmények. Ők három mitokondriális (12S rDNS, 16S rDNS és COI) és két nukleáris (18S rDNS és 28S rDNS) génszakaszt vizsgálva tizennégy génusz nyolcvanhat fajának filogenetikai összehasonlítását végezték el. Eredményeik megerősítették az Enchytraeidae család monofiletikusságát, továbbá rámutattak arra is, hogy a génuszok is monofiletikusak. Kivételt képezett a Lumbricillus génusz, amelyet parafiletikusnak találtak, valamint felvetették a Marionina génusz reviziójának sürgősségét, éppen polifiletikus volta miatt. Megállapították továbbá, hogy a Fridericia génuszban amellett, hogy monofiletikus kláduszt alkot, a génuszon belüli alacsony felbontás és más génuszokhoz viszonyítva kisebb genetikai távolságok miatt feltételezhető a közelmúltban végbement nagymértékű szétterjedés.

A molekuláris vizsgálatok alkalmazása kezd elterjedni az új fajok leírásának területén is, így például Pierre De Wit és Christer Erséus (2010) a mitokondriális COI- és a nukleáris ITS-régió szekvenálása és összehasonlítása alapján írta le új fajként a kizárólag tengerben élő génuszból a Grania occultát.


Hazai kutatások és eredmények


Az enchytraeida-kutatás hazánkban több mint negyven éve folyik, ez idő alatt hatvan új fajt, három alfajt és három új génuszt írtunk le a világ különböző részeiről, ezen belül a hazai faunából tizenöt génuszból kilencvenhat fajt mutattunk ki, amelyek közül huszonnégy a tudományra nézve is új volt. Mivel a taxonómiai munka során az enchytraeidák morfológiai identifikálásában nagyon sok (> 30) bélyeg kombinációját használjuk, egyes esetekben nehéz eldönteni, hogy az eltérő struktúrák önálló fajokra utalnak, vagy intraspecifikus variációról van-e szó. Mivel ez a probléma többször is előkerült, vizsgálatainkban a hangsúlyt ezek megoldására fektettük. A hasonló fajok elkülönítésében, illetve morfológiai bélyegeikben kissé eltérő fajok azonosságának megállapításában a morfológiai és a molekuláris módszereket mindig együttesen alkalmaztuk. Az ITS-régió, valamint a COI szekvenálása, valamint ezek többféle filogenetikai rekonstrukciós módszerekkel történő kiértékelése többnyire megoldotta a taxonómiai nehézségeket.
A következőkben néhány ilyen probléma sikeres megoldásáról számolunk be.

1. A Fridericia bulboides csoportba tartozó négy faj biztos elkülönítését a feltűnően hasonló felépítésű spermatheca teszi problémássá. A morfológiai eltérések alapos felülvizsgálatához segítségül hívtuk a PCR-RFLP-technikát, és végül az ITS-régió restrikciós enzimekkel való emésztésével sikerült megfelelően elkülöníteni a fajokat egy tudományra új faj (Fridericia schmelzi) leírása mellett (Cech – Dózsa-Farkas, 2005). A későbbiekben szekvenciaanalízist is végeztünk, ami megerősítette az előző eredményeket.

2. Ugyanakkor a F. bulboidesen belül két morfológiailag meglehetősen eltérő (ami a spermatölcsér, a penialis bulbus eltérő méretében és a spermatheca kivezető járatánál kialakuló mirigyek megjelenésében mutatkozott) variánst találtunk, azonban sem a PCR-RFLP, sem a szekvenciaelemzés nem mutatott ki lényeges különbséget közöttük. Ezúttal is bebizonyíthattuk, hogy nem minden morfológiai különbség jelez faji divergenciát, ilyenkor fajon belüli (intraspecifikus) varianciával állunk szemben.

3. Hasonlóan, az előbbi technika segítségével sikerült a F. ratzeli csoporton belül három nagyobb termetű, hasonló típusú spermathecával rendelkező faj biztos szétválasztása, aminek eredményeképpen két tudományra új faj (F. eiseni, F. crassiductata) leírását is adtuk (Dózsa-Farkas – Cech, 2006).

4. Az 1980-as évek végén kutatásokat folytattunk hazai tőzeg- (Sphagnum-) lápokon, így a keleméri Kismohoson is. Ennek eredményeképp Dózsa-Farkas Klára leírt egy új Mesenchytraeus fajt (M. kuhnelti), valamint egy új alfajt (Bryodrilus ehlersi glandulosus). Ez utóbbit 2010-ben B. glandulosus néven faji rangra emelték. Mindkét esetben egy-egy eltérő morfológiai bélyeg képezte az új taxon kialakítását. A B. glandulosusnál ezt a bélyeget a spermatheca ectalis nyílásánál előforduló mirigyek megléte jelentette (a B. ehlersinél ennek hiánya), a Mesenchytraeus kuhneltinél pedig a hímivarvezeték végső kiszélesedő részét alkotó atriumba torkolló négy atriális mirigy alkotta, amely a hozzá közelálló M. pellicensis fajnál a leírás szerint hiányzott. Akkoriban úgy véltük, hogy ezek a morfológiai különbségek a környezetétől teljesen eltérő kis tőzegmohalápban jégkorszak utáni (posztglaciális) izolált fejlődés eredményeiképp alakulhattak ki. Az idők során egyre több féreg került elő mindkét taxonból, szélesebb geográfiai elterjedési körből. Alapos vizsgálattal kiderült, hogy a más kutatók által B. ehlersinek tartott példányok esetében is mindig megtalálhatók az ektális mirigyek, csak alkalmanként nehezen láthatók. A két Mesenchytraeus fajnál pedig a négy mirigy megléte, részleges vagy teljes hiánya variálódó bélyeg, ráadásul ez is nehezen észlelhető. Felmerült tehát a fajok összevonásának esetleges szükségszerűsége. A probléma megoldását a molekuláris vizsgálatok eredményei adták. Ebben az esetben is az ITS-régió szekvenálását végeztük el. Mindkét faj esetében minimális változatosság volt tapasztalható az ITS-szekvenciákban, mindössze néhány eltérő (1–5) nukleotid fordult elő a megközelítőleg ezer bázispár hosszú szekvenciákban. Ennek alapján mindkét esetben fajrevíziót és szinonimizálást hajtottunk végre (Cech et al., 2012).

5. Két morfológiailag látszólag jelentősen eltérő faj (Bryodrilus librus és B. parvus) faji azonosságának igazolására (szinonimizálására) a citokróm oxidáz I alegységét (COI) vizsgáltuk meg.

 

 

A B. parvust Grönlandról írták le 1970-ben. Az eddigi adatok szerint ezt a fajt tipikus északi, holarktikus elterjedésűnek mondhattuk. A B. librust Dániából írták le 1959-ben Marionina libra néven, s később tették át a Bryodrilus génuszba. Mindkét faj lényegében észak-európai előfordulásúnak mutatkozott. Ennek ellenére a B. librus 2009-ben előkerült Magyarországról, a Kiskunság területéről, majd 2010-ben a Mezőföldön is megtaláltuk a B.parvussal együtt. Feltűnt a két faj nagyfokú hasonlósága (3–4 mm hossz, jellegzetes azonos nyelőcsövi kitüremkedések, azonos méretű és alakú spermatölcsérek, jellegzetes ragacsos anyagot termelő bőrmirigyek megléte, ami miatt mindkét taxon talajszemcsékkel borított), de egy eddig fontosnak tartott bélyegben különböztek. A B. parvus esetében a két spermatheca egyesülés után a nyelőcsőbe torkollik, a B. librus esetében pedig, a nevének megfelelően, szabadon lóg a testüregben. Ezért a különböző helyekről (a hazai példányok mellett a Spitzbergákról, a kanadai arktikus szigetvilágból, Alaszkából, Grönlandról és Szibériából rendelkezésünkre álló élő és/vagy fixált állatok tanulmányozásával egy időben férgeket küldtünk a Canadian Centre for DNA Barcodingnak molekuláris biológiai vizsgálatokra is. Ennek eredményeképp megállapítható volt, hogy a két faj azonos. A genetikai távolságokat összehasonlítva egymással és két másik Bryodrilus fajjal, megállapítható volt, hogy a magas interspecifikus értékekkel szemben (21,6%, illetve 22,6%) a két fajnak tartott egyedek a klaszteren belül is keverednek, és az átlagos klaszteren belüli variancia pedig csekély, mintegy 2,6%. A magyarországi B. librus, illetve parvusnak tartott egyedek pedig genetikailag egyáltalán nem különültek el. Ezzel a molekuláris biológiai igazolással a B. parvust a B. librus szinonimjaként revideáltuk (Dózsa-Farkas et al., 2012).

6. Végül még egy egészen friss kutatási eredményről is szeretnénk beszámolni, amit a kanadai arktikus szigetvilágból (Bank Island) leírt, és ott endemikusnak vélt faj a Hemifridericia bivesiculata Christensen és Dózsa-Farkas, 2006) váratlan hazai felbukkanása hívott életre. A génuszba mindössze két faj tartozik, az előbb említett faj és a H. parva Nielsen és Christensen, 1995; utóbbi a Holarktiszban szélesebben elterjedt, így hazánkban is. A két faj első megközelítésben nagyon hasonló: 2–3 mm hosszúak, coelomocytáik és spermatölcséreik is azonos méretűek és alakúak. Megegyeznek egy másik, az enchytraeidák körében igen ritka bélyegben is: mindkettőnél fejlett sertéket találunk a nyeregszelvényben (XII), méghozzá ventrálisan is. A H. bivesiculata csak a kettős hólyagszerű nyelőcsövi kitüremkedés (bivesiculata elnevezés!) alapján különítődött el, amely a másik fajnál hiányzik. A biztos faji elkülönülés megállapítására a H. bivesiculata hazai példányait, amelyeket a Mezőföldről és a Kiskunságból gyűjtöttünk, valamint a típusokat, a H. parva esetében pedig földrajzilag távoli populációkból (így Alaszkából, az ausztriai Rax-hegységből, továbbá a Kiskunságból és Bátorligetről) származó élő és fixált egyedeket tanulmányoztuk morfológiailag, valamint ITS-szekvenálást hajtottunk végre. Az ITS-vizsgálatok eredményei alapján megállapítható volt, hogy a két faj közel rokon volta mellett, önálló fajoknak tekinthető, és sikerült további morfológiai bélyegkülönbségeket is feltárni. Ilyen az agy eltérő alakja, a hasi serték száma és elhelyezkedése, és a háti véredény eredésének eltérő volta. Eredményeinkről hamarosan elkészül a tudományos cikk is.


Kitekintés


A fentiekből közvetlenül is következik, hogy a molekuláris biológiai módszerek a további taxonómiai munka nélkülözhetetlen részévé kell váljanak. A kutatók úgy képzelik, hogy a jövőben a szekvenciaalapú identifikáció révén a molekuláris vizsgálatok használhatók lesznek ökológiai, diverzitásbiológiai kutatások céljaira is, nagymennyiségű talajmintákból kinyert (akár ivaréretlen állapotú) férgek azonosításával.

Ennek eléréséhez most a cél az egységes módszerek kidolgozása. Schmelz és munkatársai indítottak el napjainkban egy projektet, amely arra irányult, hogy megfelelő célszekvenciát találjanak a televényférgek egységes molekuláris azonosítására, aminek első eredményeit a közelmúltban ismertették egy előadásban (Rüdiger M. Schmelz szóbeli közlése alapján). Vizsgálataikban négy gént vettek górcső alá, a COI-t, a 18S rDNS-t, az ITS-régiót, valamint a H3 hiszton fehérje génjét. Céljukhoz 200–300 bázispár hosszúságú szakaszokat kerestek, amelyeket általánosan lehetne használni az Enchytraeidae családon belül. A jövőbeli kutatásokra a H3-gént ajánlották, mivel megfelelő variabilitással bír, és metodikailag is könnyebben kivitelezhető, ugyanakkor megjegyzendő, hogy eddig egyetlen szekvenciát sem publikáltak erről a génről az Enchytraeidae család köréből.

Fontosnak tartjuk megjegyezni: ahhoz, hogy ne csak számozott férgek jelentsék az eredményt, hanem mögöttük ismerjük az egyes fajokat is, előbb elengedhetetlenül szükség lenne megbízható specialisták előzetes taxonómiai munkájára is, ily módon remélhetően a taxonómusok munkája ismét méltó elismertséget fog elérni. Ezen munka alapján aztán nemzetközi együttműködésben megfelelő adatbázist lehet és kell létrehozni.
 



Kulcsszavak: gyűrűsférgek, televényférgek, morfológia, molekuláris filogenetika, enzim-polimorfizmus, mitokondriális DNS, nukleáris DNS, PCR-RFLP-technika, fajrevíziók, új fajok Magyarországról
 


 

IRODALOM

Brockmeyer, Volker (1991): Isozymes and General Protein Patterns for Use in Discrimination and Identification of Enchytraeus Species (Annelida, Oligochaeta). Zeitschrift für Zoologische Systematik und Evolutionsforschung 29, 343–361. DOI: 10.1111/j.1439-0469.1991.tb00457.x

Cech Gábor – Dózsa-Farkas Klára (2005): Identification of Fridericia schmelzi sp.n. Combining Morphological Characters and PCR-RFLP Analysis. In: Pop, Victor – Pop, Antonina (eds.): Advances in Earthworm Taxonomy II (Annelida: Oligochaeta). Cluj University Press, 99–118.

Cech Gábor – Boros G. – Dózsa-Farkas K. (2012): Revision of Bryodrilus glandulosus (Dózsa-Farkas, 1990) and Mesenchytraeus kuehnelti Dózsa-Farkas, 1991 (Oligochaeta: Enchytraeidae). Zoologischer Anzeiger – Journal of Comparative Zoology. 2513, 253– 262. DOI:10.1016/j.jcz.2011.09.005

Christensen, Bent – Berg, U. – Jelnes J. (1976): A Comparative Study on Enzyme Polymorphism in Sympatric Diploid and Triploid Forms of Lumbricillus lineatus (Enchytraidae, Oligochaeta). Hereditas. 84, 41–48. DOI: 10.1111/j.1601-5223.1976.tb01194.x • WEBCÍM

Christensen, Bent – Glenner, Henrik (2010): Molecular Phylogeny of Enchytraeidae (Oligochaeta) Indicates Separate Invasions of the Terrestrial Environment. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research. 48, 208–212. DOI: 10.1111/j.1439-0469.2009. 00558.x

De Wit, Pierre – Erséus, Christer (2010): Genetic Variation and Phylogeny of Scandinavian Species of Grania (Annelida: Clitellata: Enchytraeidae), with the Discovery of a Cryptic Species. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research. 48, 285–293. DOI: 10.1111/j.1439-0469.2010.00571.x

Dózsa-Farkas, Klára – Cech, Gábor (2006): Description of a New Fridericia Species (Oligochaeta: Enchytraeidae) and Its Molecular Comparison with two Morphologically Similar Species by PCR-RFLP. Zootaxa. 1310, 53–68. • WEBCÍM

Dózsa-Farkas, Klára – Porco, D. – Boros G. (2012): Are Bryodrilus parvus Nurminen, 1970 and Bryodrilus librus (Nielsen and Christensen, 1959) (Annelida: Enchytraeidae) Really Different Species? A Revision Based on DNA Barcodes and Morphological Data. Zootaxa. 3276, 38–50. • WEBCÍM

Erséus, Christer – Rota, E. – Matamoros, L.– De Wit, P. (2010): Molecular Phylogeny of Enchytraeidae (Annelida, Clitellata). Molecular Phylogenetics and Evolution. 57, 849–858. doi: 10.1016/j.ympev.2010. 07.005

Schmelz, Rüdiger M. (2003): Taxonomy of Fridericia (Oligochaeta, Enchytraeidae).  Revision of Species with Morphological and Biochemical Methods: Abhandlung des Naturwissenschaftlichen Vereins in Hamburg (ed. Otto Kraus). No 38. DOI:10.1016/j.pedobi.2004.03.001

Schmelz, Rüdiger M. – Collado, R. – Myohara, M. (2000): A Taxonomic Study of Enchytraeus japonensis (Enchtraeidae, (Oligochaeta): Morphological and Biochemical Comparisons with E. bigeminus. Zoological Science. 17, 505–516. DOI:10.2108/0289-0003(2000)17[505:ATSOEJ]2.0.CO;2 • WEBCÍM