|
eredményező inszerciós mutációkat okoz. Ugyanakkor
a T-DNS ismert szekvenciáinak beépülése ismeretlen génekbe lehetővé
teszi a mutáns gének azonosítását, például a T-DNS
határszekvenciáihoz kapcsolódó növényi kromoszómális DNS-fragmentek
izolálása és szekvenálása segítségével. Olyan T-DNS-eket használva,
amelyek határszekvenciáikhoz kapcsolva egy riporter fehérje (például
kanamicin foszfotranszferáz, béta-glükuronidáz, zöld fluoreszcens
protein etc.) kódoló régióját hordozzák, a növényi génekben
lokalizált T-DNS-inszerciók könnyen azonosíthatók. Ugyanis, ha a
T-DNS-be épített riporter gént a növényi génen áthaladó
transzkripció mRNS-se átírja, akkor a riporter fehérje (amely
hordozhatja a növényi gén által kódolt fehérje egy szegmentjét is)
termelődése a transzformált növények sejtjeiben észlelhető (például
szövettani festéssel követve annak enzimaktivitását vagy
mikroszkóppal vizsgálva fluoreszcens fénykibocsátó képességét). E
technika fölhasználásával a génekben azonosított T-DNS inszerciók
gyakorisága hasonlónak bizonyult a lúdfűben, haploid Nicotiana
plumbaginifoliában és allotetraploid dohányban. Mivel e három
növényfaj sejtmagi DNS-ének (ún. genomjának) mérete és az abban
kódolt gének száma jelentősen különbözik egymástól (Arabidopsis 132
Mbp, 33 600 gén; dohány 3613Mbp, 90 000 gén), ez az eredmény azt
jelezte, hogy a T-DNS a várt véletlen eloszlással szemben nagy
gyakorisággal épül génekbe (Koncz et al., 1989). Az első
T-DNS-inszercióval azonosított génmutáció jellemzése után a lúdfű
CH42 (protoporfirin Mg2+-kelatáz) génjében (Koncz et al., 1990)
valóban sikerült nemzetközi összefogással az Arabidopsis legtöbb
génjében legalább egy T-DNS inszerciós mutációt azonosítani, ami
lehetővé tette azok funkcionális analízisét. Többek között ez
vezetett például ahhoz a felismeréshez is, hogy az állatokhoz
hasonlóan a növényekben is működnek alapvető életfunkciókat
szabályozó szteroid hormonok (Szekeres et al., 1996). A
T-DNS-inszerciókat környező növényi DNS-szekvenciák összehasonlító
vizsgálata ugyanakkor fontos információt szolgáltatott a T-DNS
beépülését irányító nem-homológ (ún. illegitim) rekombinációs
folyamat részleteiről (Mayerhofer et al., 1991). Az a tény, hogy a
megvizsgált inszerciók döntő többségében a T-szál virD2 pilóta
fehérje által védett 5’-vége pontosan kapcsolódott a beépülés során
a növényi célszekvenciákhoz, azt jelezte, hogy a virD2 relaxáz
fehérje aktív szerepet játszik a T-DNS kromoszomális beépülési
folyamatában.
A T-DNS beépülési helyeinek gyakoriságát vizsgálva
a gének különböző régióiban kiderült, hogy a gének kódoló
szekvenciáihoz hasonlítva a T-DNS-inszerciók átlagos száma
lényegesen magasabb a kromoszomális génhurkok egymással kölcsönható
5’-végi promoter és 3’-végi poliadenilációs szignálszekvenciákat
hordozó régióiban (Szabados et al., 2002). Ez azt jelezte, hogy a
T-DNS-hez kovalensen kapcsolódó virD2-fehérje, amely szükséges a
T-szál sejtmagi importjához, kölcsönhathat olyan kromatin
fehérjékkel, amelyek a gének promoter, illetve 3’-régiójában
lokalizálódnak. Az ezt követő virD2-fehérje kölcsönhatási
vizsgálatok ahhoz a meglepő észleléshez vezettek, hogy az
integrálódó T-DNS virD2 pilóta fehérjéje a sejtmagban a
TATA-boksz-kötő TBP-fehérjéhez kapcsolódik, amely minden eukarióta
organizmusban megtalálható (Bakó et al., 2003). A TBP, mint az
RNS-polimeráz II (RNSPII) enzim TFIID általános transzkripciós
faktorának központi alegysége, kulcsszerepet játszik az eukarióta
gének promóter régióiban található konzervált TAATA-szekvenciák
felismerésében és a transzkripciót elindító RNSPII-komplexek
összeállásában a promótereken. Emellett a TBP képes differenciáltan
fölismerni különböző DNS-hibákat, és emlőssejtekben kölcsönhat a DNS
javítási mechanizmusok egyik kulcs szabályozó faktorával, a p53
tumorszuppresszor fehérjével.
A növényi sejtmagokban a virD2-fehérje a vártnál
magasabb molekulatömeget mutat, ami a fehérje foszforilációjának
tulajdonítható. A virD2 foszforilálásáért felelős protein kináz
tisztítása során együtt frakcionálódik a TFIID- és
RNSPII-komplexekkel, és foszforilálja az RNSPII legnagyobb
alegységének C-terminális doménjében (RNSPII-CTD-ben) található
Y1S2P3T4S5P6S7 ismétlődő peptidrégiókat, amelyek közismerten fontos
szerepet játszanak az RNSPII és a transzkripció különböző fázisait
irányító faktorok kölcsönhatásaiban (Hajheidari et al., 2013).
További vizsgálatok kiderítették, hogy a virD2-kináz izolálható egy
olyan ellenanyaggal, amely az RNSPII TFIIH komplexének egyik
alegységét, a ciklin-H által aktivált CDKD;2-kinázt ismeri fel.
A TFIIH nemcsak a transzkripció egyes lépéseit
irányítja, de központi szerepet játszik a DNS-javítás folyamataiban
és a sejtosztódást szabályozó ciklinfüggő kinázok (CDK-k)
aktiválásában. A növényi TFIIH-kapcsolt CDKD-kinázok funkciói
hasonlóak a humán CDK7-kinázéhoz, amely krónikus aktiválódást mutat
az immortalizált tumorok többségében. Ugyanakkor a CDK7-tel kapcsolt
TFIIH-alegységek DNS-javítási folyamatokat gátló hibái a közismert
ultraibolya sugárérzékenységet okozó genetikai betegségek (például
Xeroderma pigmentosum és Cockayne-szindrómák) okai (Egly – Coin,
2011; Fisher, 2012). A növényi TFIIH-kinázok újabb vizsgálatai
kiderítették, hogy Arabidopsisban a humán CDK7 funkcióját három
egymáshoz hasonló CDKD-kináz látja el, amelyeket a
TFIIH-komplexekben egy, eddig csak növényekben ismert
CDKF-mesterkináz aktivál. A humán CDK7-hez hasonlóan, a növényi
CDKD-k az RNSPII-CTD ismétlődő peptidmotívumainak szerin-5 (S5)
pozícióit foszforilálják, és ezzel stimulálják a transzkripció
indítását az RNSPII által átírt géneken. Az őket aktiváló CDKF-kináz
a CTD-peptidek utolsó, szerin-7 (S7) pozícióiba épít
foszfátcsoportokat, amely szükséges ahhoz, hogy a
sejtdifferenciálódást irányító mikroRNS-ek és más géncsöndesítő kis
RNS-ek transzkripciója és biogenezise helyesen történjen meg
(Hajheidari et al., 2012).
A CDKF-gén mutációja Arabidopsisban a CDKD-kinázok
aktivitását nagyban lecsökkenti, ami drasztikusan gátolja a
sejtosztódást. Ezért a cdkf-mutánsok extrém törpe növekedést
mutatnak. Ezzel szemben mindhárom CDKD-gén inaktiválása gátolja a
sejtosztódást, és a hármas mutációt hordozó sejtek nem életképesek.
A közelmúltban végzett kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a
CDKF-kináz inaktiválása teljesen meggátolja az agrobaktérium
T-DNS-sel indukált tumorképződést. Hasonlóan a CDKD-gének egyedi és
kombinált mutációi lecsökkentik a tumorképződés gyakoriságát. E
megfigyeléseket feltehetően az magyarázza, hogy a sejtmagba bejutó
T-DNS (T-szál) virD2 pilóta fehérjéjét a TFIIH-komplexek
CDKD-kinázaival kölcsönható CDKF-mesterkináz foszforilálja. A
virD2-relaxáz foszforilálása valószínű szükséges ahhoz, hogy a
kovalensen kötött virD2 leváljon a T-szál 5’-végéről, és azt egy, a
növényi DNS-ben található szabad 3’-véghez kapcsolja. A tumorképzés
hiánya a cdkf-mutáns növényekben azt sugallja, hogy a CDKF hiánya a
virD2 foszforilációját, és ezáltal T-DNS-integrációt segítő
funkcióját gátolja. Ezzel szemben a tumorképzés részleges gátlása a
cdkd-mutánsokban arra utal, hogy az egyes CDKF-kötő CDKD-kinázok
hiánya különböző mértékben csökkenti a TFIIH-komplexben a
virD2-fehérjét foszforiláló CDKF-kináz mennnyiségét.
Összefoglalva, a jelenleg rendelkezésre álló
eredmények azt mutatják, hogy a tumorképzésért felelős agrobaktérium
T-DNS-ének növényi kromoszómákba épülését segítő virD2 relaxáz
fehérje a sejtosztódás, DNS-javítás és transzkripció folyamatait
szabályozó TFIIH-komplexszel lép kölcsönhatásba. Mivel
eukariótákban, az élesztőtől a humán sejtekig, a TFIIH kinázai és
egyéb alegységei figyelemre méltó szerkezeti és funkcionális
hasonlóságot mutatnak, talán nem meglepő az a tény, hogy az
agrobaktérium T4SS pílusán bejuttatott T-DNS a növényekhez hasonló
módon beépül élesztő, fonalas gomba, tengeri uborka és humán sejtek
kromoszomális DNS-eibe is (idézetekért lásd: Lacroix– Citovsky,
2013). A jelenleg ismert plazmidok összehasonlító vizsgálatai azt
mutatják, hogy az agrobaktérium Ti plazmid virulenciagénjei által
kódolt virD2 relaxáz és T4SS pílus fehérjéi közeli rokonságban
állnak számtalan más baktérium plazmidján és kromoszómáján kódolt
konjugatív DNS-átvitelért felelős fehérjékkel (Smillie et al.,
2010). Ezek közé tartoznak például az RP4 és RSF1010 plazmid TraI-
és Mob-fehérjéi, amelyek képesek az agrobaktérium T4SS pílusán át
mobilizálni az RP4 és RSF1010 plazmid DNS-eket növényi sejtbe, ahol
azok a T-DNS-hez hasonlóan beépülnek a sejtmagi DNS-be. A T-DNS
átvihető számos más proteobaktérium (például rhizóbium) DNS
konjugációs rendszerével is növényi sejtbe. Továbbá, virD2-höz
hasonlóan, a TraI és Mob relaxáz fehérjék a sejtmagban halmozódnak
föl akkor is, ha bejutnak humán sejtekbe (Silby et al., 2007).
Nemrégen egy agrobaktériummal rokon virD2 és virB/D4 T4SS
transzformációs rendszert azonosítottak a humán patogén Bartonella
fajokban, amelyek képesek plazmidjaikat állati és humán sejtekbe
mobilizálni, ahol azok integrálódnak a sejtmagi kromoszómákba (Llosa
et al., 2012). Emellett ismert, hogy számtalan humán kórokozóban,
így a gyomorrák kialakulásában szerepet játszó Helicobacter
piloriban is található több virD2-vel rokon relaxáz és T4SS-t kódoló
virulenciagén (Grove et al., 2013). E megfigyelések alapján
logikusan fölmerül annak a lehetősége, hogy a baktériumokból
eukarióta sejtekbe irányuló horizontális DNS-transzfer sokkal
gyakoribb a természetben, mint azt eddig feltételeztük. Ezért a
továbbiakban szükséges megvizsgálnunk, hogy az ismert humán
patogének közül melyek képesek DNS-üket beépíteni a kromoszómákba,
és ezzel az agrobaktérium T-DNS-hez hasonlóan génmutációkat okozni.
Alkalmas védekezési stratégiák kidolgozása céljából érdekes lenne
azt is megtudnunk, hogy a sejtmagba bejutó bakteriális relaxázok az
agrobaktérium virD2-höz hasonlóan a TFIIH közvetítésével építik-e be
DNS-eiket a kromoszómákba.
Kulcsszavak: Agrobacterium, horizontális DNS-átvitel, virulencia
gének, plazmid konjugáció, transzferált DNS (T-DNS), virD2 relaxáz,
T4SS szekréciós csatorna, RNS-polimaráz II, TFIIH általános
transzkripciós faktor, genetikailag módosított növények
IRODALOM
Bakó László – Umeda, M. – Tiburcio, A. F.
– Schell, J. – Koncz C. (2003): The VirD2 Pilot Protein of
Agrobacterium-transferred DNA Interacts with the TATA Box-binding
Protein and a Nuclear Protein Kinase in Plants. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA. 100, 10108–10113. DOI:
10.1073/pnas.1733208100 •
WEBCÍM
Chilton, Mary-Dell – Drummond, M. H. –
Merlo, D. J. – Sciaky, D. (1978): Highly Conserved DNA of Ti
Plasmids Overlaps T-DNA Maintained in Plant Tumors. Nature. 275,
147–149. DOI: 10.1038/ 275147a0
Depicker, Ann – Van Montagu, M. – Schell,
J. (1978): Homologous Sequences in Different Ti Plasmids Are
Essential for Oncogenicity. Nature. 275, 150–152.
DOI:10.1038/275150a0
Egly, Jean-Marc – Coin, Frédéric (2011): A
History of TFIIH: Two Decades of Molecular Biology on a Pivotal
Transcription/Repair Factor. DNA Repair. 10, 714–721. DOI:
10.1016/j.dnarep.2011.04.021
Fisher, Robert P. (2012): The CDK Network:
Linking Cycles of Cell Division and Gene Expression. Genes & Cancer.
3, 731–738. DOI: 10.1177/1947601912473308 •
WEBCÍM
Grove, Jane I. – Alandiyjany, M. N. –
Delahay, R. M. (2013): Site-specific Relaxase Activity of a
VirD2-like Protein Encoded within the tfs4 Genomic Island of
Helicobacter pylori. The Journal of Biological Chemistry. 288, 37,
26385–26396. DOI: 10.1074/jbc.M113.496430 •
WEBCÍM
Hajheidari, Mohsen – Farrona, S. –
Huettel, B. – Koncz Zs. – Koncz Cs. (2012): CDKF;1 and CDKD Protein
Kinases Regulate Phosphorylation of Serine Residues in the
C-terminal Domain of Arabidopsis RNA Polymerase II. The Plant Cell.
24, 1626–1642. DOI: 10.1105/tpc.112.096834 •
WEBCÍM
Hajheidari, Mohsen – Koncz Cs. – Eick, D.
(2013): Emerging Roles for RNA Polymerase II CTD in Arabidopsis.
Trends in Plant Science. 18, 633–643. DOI:
10.1016/j.tplants.2013.07.001 • WEBCÍM
Herrera-Estrella, L. – Depicker, A. – Van
Montagu, M. – Schell, J. (1983): Expression of Chimaeric Genes
Transferred into Plant Cells Using a Ti-plasmid-derived Vector.
Nature. 303, 209–213. DOI: 10.1038/ 303209a0
Koncz Csaba – Schell, Jeff (1986): The
Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-specific Expression of
Chimaeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary
Vector. Molecular and General Genetics. 204, 383–396. DOI:
10.1007/BF00331014 •
WEBCÍM
Koncz Csaba – Martini, N. – Mayerhofer, R.
– Koncz-Kálmán Zs. – Körber, H. – Rédei G. P. – Schell, J. (1989):
High-frequency T-DNA-mediated Gene Tagging in Plants. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA. 86, 8467–8471. •
WEBCÍM
Koncz Csaba – Mayerhofer, R. –
Koncz-Kálmán Zs. – Nawrath, C. – Reiss, B. – Rédei G. P. – Schell,
J. (1990): Isolation of a Gene Encoding a Novel Chloroplast Protein
by T-DNA Tagging in Arabidopsis thaliana. The EMBO Journal. 9,
1337–1346. •
WEBCÍM
Lacroix, Benoît – Citovsky, Vitaly (2013):
The Roles of Bacterial and Host Plant Factors in
Agrobacterium-mediated Genetic Transformation. The International
Journal of Developmental Biology. 57, 467–481. DOI:
10.1387/ijdb.130199bl •
WEBCÍM
Llosa, Matxalen – Schröder, G. – Dehio, C.
(2012): New Perspectives into Bacterial DNA Transfer to Human Cells.
Trends in Microbiology. 20, 355–339. DOI: 10.1016/j.tim.2012.05.008
Mayerhofer, Reinhold – Koncz-Kálmán Zs. –
Nawrath, C. – Bakkeren, G. – Crameri, A. – Angelis, K. – Rédei, G.
P. – Schell, J. – Hohn, B. – Koncz, C. (1991): T-DNA Integration: A
Mode of Illegitimate Recombination in Plants. The EMBO Journal. 10,
697–704. •
WEBCÍM
Silby, M. W. – Ferguson, G. C. –
Billington, C. – Heinemann, J. A. (2007): Localization of the
Plasmid-encoded Proteins TraI and MobA in Eukaryotic Cells. Plasmid.
57, 118–130. DOI: 10.1016/j.plasmid. 2006.08.006 •
WEBCÍM
Smillie, C. – Garcillán-Barcia, M. P. –
Francia, M. V. – Rocha, E. P. – de la Cruz, F. (2010): Mobility of
Plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 434–452.
DOI: 10.1128/MMBR.00020-10 •
WEBCÍM
Szabados László – Kovács I. – Oberschall
A. – Ábrahám E. – Kerekes I. – Zsigmond L. – Nagy R. – Alvarado, M.
– Krasovskaja, I. – Gál M. – Berente A. – Rédei G. P. – Haim, A. B.
– Koncz Cs. (2002): Distribution of 1000 Sequenced T-DNA Tags in the
Arabidopsis Genome. Plant J. 32, 233-242. DOI: 10.1046/j.
1365-313X.2002.01417.x •
WEBCÍM
Szekeres M. – Németh K. – Koncz-Kálmán Zs.
– Mathur, J. – Kauschmann, A. – Altmann, T. – Rédei G. P. – Nagy F.
– Schell, J. – Koncz Cs. (1996): Brassinosteroids Rescue the
Deficiency of CYP90, a Cytochrome P450, Controlling Cell Elongation
and De-etiolation in Arabidopsis. Cell. 85, 171–182. •
WEBCÍM
Zaenen, I. – van Larebeke, N. – Touchy, H.
– Van Montagu, M. – Schell, J. (1974): Super-coiled Circular DNA in
Crown-gall Inducing Agrobacterium Strains. Journal of Molecular
Biology. 86, 109–127. DOI: 10.1016/S0022-2836(74)80011-2 •
WEBCÍM
Zambryski, P. – Joos, H. – Genetello, C. –
Leemans, J. – Van Montagu, M. – Schell, J. (1983): Tiplasmid Vector
for the Introduction of DNA into Plant Cells without Alteration of
Their Normal Regeneration Capacity. The EMBO J. 2, 2143–2150. •
WEBCÍM
|
