Az optikai csipesz igen széles körben elterjedt az élettudományok területén, mivel segítségével akár egyedi sejtek is vizsgálhatók. A módszer alapja egy nagy numerikus apertúrájú fókuszált lézernyaláb, amely képes mikronméretű objektumokat három dimenzióban csapdázni (Grier, 2003). Optikai csipesz alkalmazásával többnyire csak a sejtek helyzete manipulálható. Komplex vizsgálatok elvégzése során azonban gyakran nem elegendő csupán a helyzetüket kontrollálni, orientációjukat is irányítani kell. A sejtek direkt csapdázása során ez korlátozottan vagy egyáltalán nem lehetséges. Ráadásul direkt csapdázás során erős sugárzás éri a sejteket, ami a károsodásukhoz, elpusztulásukhoz vezethet. Kísérleteink célja, hogy optikai csipesz segítségével a sejteket az eltoláson túl forgatással (6 szabadsági fokkal) is tudjuk manipulálni, úgy, hogy a sérülésüket is elkerüljük. Az említett problémáknak általunk megvalósított megoldása a sejtek indirekt manipulációja. Ennek során egy speciálisan kialakított mikroeszközhöz rögzítjük a sejteket, majd a mikroeszközt optikai csipesszel csapdázva indirekt módon mozgathatók.

A feladat megvalósításának első lépésében kétfotonos polimerizációval előállítottuk a mikroeszközt. A fotopolimerizáció során lézerfényt fókuszáltunk SU8 fotopolimerbe, és a fókuszt három dimenzióban mozgattuk. Utólagos hő- és kémiai kezelés hatására csak azok a tartományok maradtak meg, amelyeket előzőleg megvilágítottunk (Vizsnyiczai, 2014). Az így előállított sejtmanipulátorról elektronmikroszkópos felvétel látható az 1.a ábrán. A struktúrák előállítását követően mind a sejtek (K562 sejtvonal), mind a mikromanipulátorok felületét biokémiai úton kezeltük. A mikroeszköz felületét sztreptavidinnel, a sejtek felületét biotinnal vontuk be. Ez az eljárás tette lehetővé, hogy a manipulátorok és a sejtek nagy hatékonysággal összeragadjanak, ahogy az 1.b ábrán megfigyelhető.

1. ábra • a – elektronmikroszkópos felvétel

a fotopolimerizációval előállított manipulátorról;

b – az összeragadt sejt és struktúra optikai mikroszkópos képe

A 6 szabadsági fokú mozgatás megköveteli, hogy legalább három ponton egymástól függetlenül mozgatni tudjuk a mikromanipulátort. Ezt hagyományos, egy csapdával működő optikai csipesszel nem lehet megvalósítani, ezért holografikus eljárást alkalmaztunk. A holografikus optikai csipesz a hagyományos technika kiterjesztése, melynek során tetszőleges számú (jellemzően néhányszor tíz) pontra tudjuk a fényt egyidejűleg fókuszálni, és ezeket egymástól függetlenül tudjuk irányítani. A több nyalábot speciális eszköz – térbeli fénymodulátor (SLM) – segítségével állítjuk elő, melynek aktív felületén megjelenő fáziskép vagy hologram határozza meg a

csapdák számát és helyzetét. Holografikus optikai csipesz alkalmazásával meg tudtuk valósítani a 6 szabadsági fokú mozgatást (Vizsnyiczai, 2013).

A forgatással kiterjesztett manipuláció lehetőségeinek bemutatására fluoreszcensen jelölt egyedi sejtek háromdimenziós szerkezetét határoztuk meg úgy, hogy a feloldás minden irányban a laterális feloldással legyen azonos. Általánosságban igaz, hogy a mikroszkópok feloldása az optikai tengely (a megfigyelés iránya) mentén sokkal rosszabb, mint laterálisan. Azonban, ha különböző irányú felvételeket össze tudunk illeszteni, akkor ez a probléma megszüntethető. A sejtek háromdimenziós leképezését úgy valósítottuk meg, hogy a mikromanipulátor segítségével a sejtet az optikai tengely mentén lépésekben mozgattuk, és minden lépésben egy felvételt készítettünk. Egy sorozat elkészítése után a sejtet elforgattuk (itt kihasználtuk, hogy tetszőlegesen tudjuk orientálni a sejteket), majd újabb felvételsorozatot készítettünk. A különböző irányból kapott adatokat számítógépes algoritmussal összeillesztettük. A 2.a ábrán jól megfigyelhető az optikai tengely mentén fellépő elnyújtottság. A 2.b ábrán látható, hogy a különböző irányú felvételek egyesítése után a struktúra megnyújtottsága megszűnt, a feloldás az optikai tengely mentén megegyezik a laterális irányú feloldással.

2. ábra • K562 sejtvonal felvételsorozatokból:

a – az eredeti; b – különböző irányú felvételek összeillesztésével kapott háromdimenziós kép.

Az optikai tengely a függőleges irányba mutat.

Összegezve, a fotopolimerizációval előállított sejtmanipulátorhoz sikeresen rögzítettük a sejteket, majd holografikus optikai csipesz alkalmazásával sikerült megvalósítani 6 szabadsági fokú indirekt sejtmanipulációt. A manipuláció lehetőségeinek bemutatására egyedi sejtek olyan háromdimenziós képét állítottuk elő, ahol a feloldás minden irányban megegyezett a mikroszkóp laterális feloldásával.
 

Kulcsszavak: optikai csipesz, fotopolimerizáció, sejtmanipuláció, 3D-képalkotás
 

IRODALOM

Grier, David G. (2003): A Revolution in Optical Manipulation. Nature. 424, 810–816. DOI:10.1038/nature01935

Vizsnyiczai Gaszton – Kelemen L. – Aekbote, B. (2013): Indirect Optical Manipulation of Live Cells with Functio-nalized Polymer Microtools. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 42, S114-S114. • WEBCÍM

Vizsnyiczai Gaszton – Kelemen L. – Ormos P. (2014): Holographic Multi-focus 3D Two-photon Polymerization with Real-time Calculated Holograms. Optics Express. 22, 20, 24217-24223; DOI: 10.1364/OE.22.024217 • WEBCÍM