A Magyar Tudományos Akadémia folyóirata. Alapítva: 1840
 

KEZDŐLAP    ARCHÍVUM    IMPRESSZUM    KERESÉS


 HOGYAN ALAKÍTSUNK ÁT EGY FOTOLIÁZT KRIPTOKRÓMMÁ?

X

Lukács András

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai Intézet • andras.lukacs(kukac)aok.pte.hu

 

A természetben számos fehérje vesz részt a fény érzékelésében, illetve rendelkezik fény által „hajtott” funkcióval: a látás, a fény irányába való növekedés a növények esetében a fototaxis vagy éppen a napi ritmus szabályozása fényérzékeny vagy úgynevezett fotoaktív fehérjék segítségével valósul meg. A fotoaktív fehérjék nagy családját alkotják a fotoaktív flavoproteinek, amelyek esetében a fény érzékelésében kulcsszerepet játszik valamelyik flavin, vagyis a B-vitamin valamelyik származéka, leggyakrabban az FAD, (flavin adenin dinukletotid) valamint az FMN (flavin mononukleotid).

A fotoaktív flavoproteinek között különleges helyet foglalnak el a kriptokróm/fotoliáz fehérjecsaládba tartozó fehérjék, amelyek számos egzotikus funkcióval rendelkeznek. A kriptokróm/fotoliáz fehérjecsalád egyetlen ismert tagja sokáig a fotoliáz volt, amelyről több mint ötven évvel ezelőtt fedezték fel, hogy kék fény hatására képes a DNS-ben létrejött hibák javítására. A DNS-javítás mechanizmusát közel tíz éve sikerült tisztázni: ennek megfelelően a fényabszorpciót követően a flavin kofaktorról egy elektron „ugrik” a hibás DNS-kötésre, a pirimidin dimerre, aminek következtében a kötés felhasad – vagyis a DNS-szál javítása megtörténik –, majd az elektron visszaugrik a flavinra. A javítási folyamat fontos feltétele, hogy a flavin kofaktor (FAD) teljesen redukált (FADH–) állapotban legyen, aminek következtében a fehérjének halványsárga színe van. A fotoliázban azonban, az expresszálást és tisztítást követően a flavin a félig redukált állapotban van, aminek a jele a fehérje kékes színe. Klaus Brettel és Marten Vos kollégáim az ezredfordulón fedezték fel, hogy látható fény hatására a flavin teljesen redukálódik, méghozzá a javítási folyamatban megismerttől eltérő módon. A FAD egy elektrontranszfer kaszkád segítségével redukálódik, amelyben az FAD-hez közeli három triptofán vesz részt (Aubert et al., 2000). A folyamatot fotoaktivációnak nevezték el, amelyet közös munkánk során az elmúlt néhány évben sikerült részletesen jellemeznünk.

Kísérleteink során sikerült igazolnunk, hogy a flavin fényabszorpcióját követően a legközelebbi triptofánról (W382) egy elektron ugrik a flavinra, amely (a javításhoz szükséges) FADH- állapotba kerül. Ezt követően egy elektron ugrik a második (W359) triptofánról az elsőre, majd a terminális triptofánról (W306) a másodikra, hogy pótolja az elektronhiányt (Lukacs et al., 2006, 2008; Byrdin et al., 2010).

Hozzá kell tennünk, hogy a fotoliázban erre a folyamatra fiziológiás körülmények között nagy valószínűséggel nem kerül sor, az általunk leírt jelenségnek azonban a kriptokrómokban jut kiemelkedő szerep. A kriptokrómok a fotoliázokhoz szerkezetileg hasonló (vagyis homológ) fehérjék, amelyek azonban nagyon eltérő funkcióval rendelkeznek.

A kriptokrómok felfedezésekor – a kilencvenes évek elején – eleinte az sem volt világos, hogy mi a fehérje funkciója, innen származik az elnevezés is. Később kiderült, hogy a fehérje egy kék fény fotoreceptor, amely a növényekben a növekedés szabályozásában vesz részt. 1996-ban fedezték fel, hogy a kriptokrómok emberekben és egerekben is megtalálhatóak, majd 1998-ban sikerült bizonyítani, hogy ezek a fehérjék fénytől függően vagy akár attól függetlenül is a cirkadián ritmus szabályozásában vesznek részt (Chaves et al., 2011). Nemrégiben vált ismertté a kriptokrómok talán legegzotikusabb funkciója, a Föld mágneses terének „érzékelése”, amivel a költöző madarak tájékozódása megvalósul. A fényabszorpciót követően a kriptokrómokban ugyanis egy flavin és egy triptofán gyökpár jön létre, ami kölcsönhat a föld mágneses terével (Dodson et al., 2013).

Munkánk során arra a kérdésre keressük a választ, hogy a nagyfokú homológia ellenére mi az

 

 

oka a fotoliázok és kriptokrómok funkciójában tapasztalt jelentős eltérésnek. Tekintettel arra, hogy a kriptokrómokban a FAD oxidált állapotban található meg, a fotoliázokban pedig félig redukált állapotban, abból indultunk ki, hogy a két fehérje működését a FAD redox állapota befolyásolja. Martin Byrdin és Klaus Brettel kollégáim korábban arra a következtetésre jutottak, hogy a FAD redox állapotát a flavin gyűrűjéhez közel eső aminosav határozza meg (Balland et al., 2009). Kriptokrómokban ez egy aszpartát, a fotoliázban pedig egy aszparagin. Elsőként tehát létrehoztuk az N378D fotoliáz mutánst, amelynek esetében az aszparagint egy aszpartátra cseréltük. Ennek eredményeként a FAD oxidált állapotba került, szemben a vad típusnál megfigyelt félig redukált állapottal.

Tekintettel arra, hogy a fényabszorpciót követő elektrontranszfer kaszkád kevesebb mint 100 ps alatt megvalósul, vizsgálatainkhoz tranziens abszorpciót és femtoszekundumos lézereket – az impulzushossz tízezerszer rövidebb, mint a másodperc milliárdod része – használtunk. (Ez érthető, ha arra gondolunk, hogy ha egy gyorsan mozgó tárgyról akarunk fényképet készíteni, akkor a zársebességnek nagyon rövidnek kell lennie, hogy a kép ne legyen elmosódott).

Tranziens abszorpciós méréseink azt mutatták, hogy a mutáns fotoliáz – amelynek esetében az aminosavcsere oxidált állapotba vitte a FAD-t – fotociklusa jelentősen megváltozott, és nagyon hasonló lett a kriptokrómoknál megismert fotociklushoz. Ez gyakorlatilag arra utal, hogy az FAD redox állapotának „kapcsolgatásával” megváltoztathatjuk a funkciót is.
 



Kulcsszavak: flavin, FAD, elektrontranszfer, fotoliáz, kriptokróm, DNS-javítás, tranziens abszorpció, femtoszekundumos lézerek
 


 

IRODALOM

Aubert, Corinne – Vos, M. H. – Mathis, P. – Eker, A. P. – Brettel, K. (2000): Intraprotein Radical Transfer during Photoactivation of DNA Photolyase. Nature. 405, 586–590. DOI:10.1038/35014644

Balland, Véronique – Byrdin, M. – Eker, A. P. – Ahmad, M. – Brettel, K. (2009): What Makes the Difference between a Cryptochrome and DNA Photolyase? A Spectroelectrochemical Comparison of the Flavin Redox Transitions. Journal of the American Chemical Society. 131, 426–427. DOI: 10.1021/ja806540j

Byrdin, Martin – Lukacs A. – Thiagarajan, V. – Eker, A. P. – Brettel, K. – Vos, M. H. (2010): Quantum Yield Measurements of Short-lived Photoactivation Intermediates in DNA Photolyase: Toward a Detailed Understanding of the Triple Tryptophan Electron Transfer Chain. The Journal of Physical Chemistry A. 114, 3207–3214. DOI: 10.1021/jp9093589

Chaves, Inês – Pokorny R. – Byrdin, M. – Hoang, N. – Ritz, T. – Brettel, K. – Essen, L-O. – van der Horst, G. T. J. – Batschauer, A. – Ahmad, M. (2011): The Cryptochromes: Blue Light Photoreceptors in Plants and Animals. Annual Review of Plant Biology. 62, 335–364. DOI: 10.1146/annurev-arplant-042110- 103759

Dodson, Charlotte A. – Hore, P. J. – Wallace, M. I. (2013): A Radical Sense of Direction: Signalling and Mechanism in Cryptochrome Magnetoreception. Trends Biochem. Sci. 38, 435–446. DOI:10.1016/j.tibs.2013.07.002

Lukacs Andras – Eker, A. P. M. – Byrdin, M. – Brettel, K. – Vos, M. H. (2008): Electron Hopping through the 15 A Triple Tryptophan Molecular Wire in DNA Photolyase Occurs within 30 ps. Journal of the American Chemical Society. 130, 14394–1435. DOI: 10.1021/ja805261m

Lukacs Andras – Eker, A. P. – Byrdin, M. – Villette, S. – Pan, J. – Brettel, K. – Vos, M. H. (2006): Role of the Middle Residue in the Triple Tryptophan Electron Transfer Chain of DNA Photolyase: Ultrafast Spectroscopy of a Trp-->Phe Mutant. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 15654–1568. DOI: 10.1021/jp063686b

 


 

 

1. ábra • Az ábrán a flavin adenin dinukleotid (FAD) és a flavin mononukleotid szerkezete látható. A flavinok fiziológiás körülmények között több redox állapotban (például: teljesen redukált, félig redukált, oxidált) létezhetnek.
 


 


 

2. ábra • Az E. coli fotoliáz szerkezete: a FAD és az elektrontranszferben részt vevő triptofán aminosavak.