Mi a hidrogenáz?

A hidrogenáz enzim, amely a H2 2 proton + 2 elektron” reakciót katalizálja. A protonok jól elvannak a vízben, ezek koncentrációja határozza meg az oldat pH-értékét. Az elektronok viszont nem szeretnek magukban lenni, ezért valamilyen elektronhordozóhoz kapcsolódnak. Ez olyan vegyület, mely meg tud kötni vagy le tud adni egy elektront. A hidrogenáz működésének mérésekor szép színes elektronhordozókat használunk, benzilviologént vagy metilviologént. Ezek kék színűek, ha az elektron rajtuk van (vagyis, ha redukáltak), s színtelenek, ha nincs rajtuk az elektron (vagyis, ha oxidáltak). Ezért az elektronok átadása igen jól megfigyelhető, mert a megjelenő intenzív kék szín jól látható és mérhető.

Mit csinálnak az enzimek?

Az enzim (katalizátor) a katalizált reakció sebességét növeli meg. Kétszer annyi enzim duplájára növeli a sebességet, négyszer annyi négyszeresére. Az enzim a reakció során egy körfolyamatban vesz részt. Különböző, egymástól kissé eltérő enzimformák alakulnak ki, például az enzim megköti az átalakítandó anyagot, apró konformációs változásokon megy keresztül stb., ezek az enzimformák egymásba alakulnak. De az enzimmolekulának végül ugyanabba az állapotba kell megérkeznie, ahonnan elindult, hogy újra képes legyen a reakciót katalizálni. A körfolyamat persze lehet egészen bonyolult, elágazó útvonalak, hurkok jöhetnek létre, de az enzim szempontjából alapvetően egy körben forgó reakcióról beszélhetünk.

Az enzim természetesen mindkét irányban katalizálja a reakciót, tehát esetünkben nemcsak a hidrogén elbontását elektronokra és protonokra, hanem a hidrogéngáz keletkezését is elektronokból és protonokból. Ha a reakciót zárt rendszerben békében hagyjuk, tehát megvárjuk, amíg egyensúlyba jut, akkor a hidrogén pontosan ugyanakkora sebességgel fog elbomlani elektronokra és protonokra, mint amilyen sebességgel az elektronokból és a protonokból hidrogéngáz keletkezik. Ez az egyensúly mindig a reakcióra jellemző, s az egyensúlyt az határozza meg, hogy a kezdetén a reakcióban szereplő anyagokból mennyit helyeztünk el a reakciótérfogatban. Az enzim (a katalizátor) ezt az egyensúlyt – elvileg – sosem változtatja meg, mert ha ez lehetséges lenne, akkor örökmozgót lehetne építeni, egyszerűen azzal, hogy az enzimet (katalizátort) ki-be tesszük a reakciótérfogatba.

Persze, ha a reakcióban valamilyen módon a katalizátor is részt vesz (például egy nemkívánatos mellékreakció a katalizátort tönkreteszi), akkor a reakció előbb-utóbb „nem katalizálttá” válik, mert a katalizátor elfogy. Ilyenkor „nem katalizált” reakció zajlik, mely esetleg olyan lassú is lehet, hogy az átalakulás megfigyelhetetlenné válik, a reakció gyakorlatilag megáll (például a hidrogéngáz magától igen-igen lassan bomlik le elektronokra és protonokra, a reakció katalizátor nélkül praktikusan megfigyelhetetlen).

Miért különleges a hidrogenáz?

A hidrogenáz azért különleges, mert úgy viselkedik, ahogy más, „normális” enzimek nem szoktak. Több olyan tulajdonsága is van, amelyik nem illik a „normális enzim” kategóriába.

Nem lineárisan növeli a sebességet • A többi enzimmel ellentétben, ha a hidrogenázból kétszer annyit adunk a reakcióhoz, a reakció sebessége nem duplázódik meg. Ha gondosan végigmérjük, hogy mennyivel növekszik meg a sebesség, akkor azt kapjuk, hogy kétszer annyi enzim csak 1,41-szeresére növeli a sebességet, négyszer annyi enzim növeli kétszeresére, és kilencszer annyi enzim hatására lesz háromszoros a sebesség. Vagyis a változás gyökös, az enzimkoncentráció négyzetgyökével arányosan nő a sebesség.

A reakció lag fázissal indul • A „normál” enzimek reakciósebessége rögtön a reakció elindulásának pillanatában maximális (miért is lenne másként?). A hidrogenáz ezzel szemben sokáig látszólag semmit nem „csinál”; „nem történik semmi”. Aztán egy bizonyos idő multán (ezt az időt hívjuk lag fázisnak) a reakció egyszer csak elindul. Ezt követően a reakció már villámgyorsan zajlik, például megtörténhet, hogy egyórás várakozás után a reakció percek alatt egyensúlyba jut.

A reakció inhomogén • Egy enzimreakcióban az enzim igen kis koncentrációban van jelen. Az enzimek darabszáma azonban igen nagy, tehát azt látjuk (mérjük), hogy a reakciótérfogatban a reakció mindenhol elindul, a reakció homogén. Minden enzimmolekula egyformán dolgozik. A hidrogenáznál azonban a reakció nem mindenhol indul el, hanem véletlenszerűen, a térfogat egyes pontjaiban, s onnan terjed ki a teljes reakciótérfogatra. Ha a reakciótérfogatot igen vékonyra alakítjuk (vékony oldatrétegben), akkor szép kék köröket láthatunk (az elektronokat felvevő festékmolekuláknak köszönhetően), melyek egyenletes sebességgel növekednek. Több kör is kialakulhat, ezek egymásba mosódnak, míg végül, az egyensúly beálltakor az egész reakciótérfogat homogénen kék nem lesz.

A végső egyensúly nem független az enzimkoncentrációtól • Az már szemre is látszik, ha az előzőekben említett táguló köröket szemléljük, hogy azok az egymást követő, más körülmények között megismételt reakciókban nem feltétlenül lesznek egyformán kékek. Ha kevés enzimet használunk, akkor egészen halványszínű reakcióelegyünk lesz, ha sokat, akkor harsány kékké válik. Ez ellentétes az enzimekről eddig alkotott tudásunkkal.

Az egyensúlyi állapotban meg is mérhetjük a koncentrációkat, így numerikusan is tudható, amit szemmel is látunk, hogy az egyensúlyi koncentrációk függenek a hozzáadott enzim mennyiségétől. A függés komplikált, de a lényeg, hogy nem független.
Az általunk detektált „egyensúly” tehát nem valódi, csak látszólagos egyensúly, mert a valódi egyensúlyban az enzim koncentrációjától való függés nem jöhetne létre.

Ugyanakkor nem arról van szó, hogy a híg enzimek „elromlanak”, s emiatt hamarabb abbahagyják a reakció katalizálását, mert ha a reakciót oda-vissza lejátszatjuk (egyszer az egyik irányba, utána a másik irányba, amit könnyen megtehetünk a hidrogén kicserélésével nitrogéngázra, majd újabb visszacserélésével hidrogéngázra), akkor ugyanazt a kékülést kapjuk. Tehát az enzim nem romlott el, mert képes volt visszafele is katalizálni a reakciót, majd újra az eredeti irányba is. Ha elromlott volna, akkor ezt nem tudtuk volna megfigyelni. Ezt az oda-vissza katalizálást sokszor meg lehet csinálni, ennek csak az szab gátat, hogy a reakcióelegy párolog, s ha sokáig hagyjuk párologni, akkor beszárad. Tehát az enzim nem „romlik” el, mégis úgy tesz, mintha elromlott, majd újra megjavult volna.

Mivel magyarázható ez a különleges viselkedés?

Kutatócsoportunk az enzim különleges viselkedését azzal magyarázza, hogy az enzim működése során két autokatalitikus reakciólépés is történik.

Mi az autokatalitikus reakció?

Ahhoz, hogy az autokatalitikus reakció végbemenjen, szükség van arra, hogy a termék reakcióba lépjen a kiindulási anyaggal (pozitív visszacsatolás). Ha formálisan akarjuk leírni, akkor az A+B 2B reakciót hívjuk (elsőrendű) autokatalitikus reakciónak. Itt a B anyag az autokatalizátor, kölcsönhatása az A anyaggal az autokatalitikus lépés. Ha akár az A anyag, akár a B anyag hiányzik, a reakció nem jön létre. Mivel a reakció során a B anyag koncentrációja folyamatosan növekszik, ezért a reakció sebessége is folyamatosan növekszik, egészen addig, míg az A anyag csökkenése ezt a hatást nem kompenzálja.

A reakció nem annyira különleges, mint képzeljük, mert például a tisztelt olvasó is egy (kissé bonyolultabb) autokatalitikus reakció terméke. Az ő létrejöttéhez két (különnemű) emberi egyedre és táplálékra volt szükség (formálisan A+B+táplálék 2A+B vagy A+B+táplálék A+2B, ez egy másodrendű autokatalitikus reakció). Elsőrendű autokatalitikus reakciókra a legismertebb példa a sejtosztódás, ahol a táplálékból egy sejt közreműködése révén két sejtünk lesz.
Autokatalitikus reakciók nem csak az élővilághoz kapcsolódnak, „tiszta” kémiai reakciókban is ismertek.

Hol vannak autokatalitikus reakciók
a hidrogenáz enzimműködése során?

A hidrogenáz a reakció kezdetén úgynevezett „inaktív” állapotban van. Az enzim aktív centruma, ahová a hidrogéngáznak be kellene kötnie, blokkolva van. Ahhoz, hogy működőképes enzim legyen belőle, „aktiválni” kell. Az aktiválás ebben az esetben azt jelenti, hogy egy (vagy több) elektront hozzá kell adni az enzimhez (redukálni kell), s ezzel az elektronnal a blokkoló anyag (ennek természete nem pontosan ismert, annyit tudunk, hogy valamilyen oxigénvegyület) eltávolítható. Az elektron jöhet valamilyen redukáló anyagtól, melyet kívülről adunk a reakcióelegyhez, de jöhet egy „aktív” hidrogenáz molekulától is, mely már megkötött és elbontott hidrogént, s ezért rendelkezik elektronnal. Ha a hidrogenázt hidrogéngáz alatt aktiváljuk, akkor más eshetőség nem is jöhet szóba. Ilyen „aktív” hidrogenáz igen kevés van, mert az enzimet általában oxigént tartalmazó közegben (levegőben) tároljuk, ahol bőven van alkalma reagálni az oxigénnel. A vékony reakciórétegben megjelenő növekvő körök középpontjában egy ilyen aktív hidrogenáz van, ezek az „aktív” molekulák a környezetünkben levő inaktív enzimeket aktiválják, ezzel a működőképes enzimek száma körkörösen nő, s ezek már tudják katalizálni a reakciót (a hidrogéngáz elbontását, az elektronhordozó kékülését).Ez a folyamat megmagyarázza a lag fázis jelenlétét is, és a reakció inhomogenitását is. Ahhoz, hogy a másik két furcsa jelenséget is megmagyarázzuk, nem elég ez az egyetlen autokatalitikus lépés. Ugyanis bármennyi enzimünk is van, ha az enzimek működőképesek, előbb-utóbb el kell érnünk az egyensúlyt. S ez az egyensúly nem függhet attól, mennyi enzimet helyezünk el a rendszerben (s esetünkben az aktív enzimek száma ráadásul egyre nő!).

A magyarázathoz arra van szükség, hogy az enzim körfolyamatában, a már aktivált enzimek egymás után következő különböző állapotok közötti átmeneteiben is létezzen egy autokatalitikus lépés. Ez az autokatalitikus lépés ugyanis képes arra, hogy az enzim körfolyamatát megszakítsa. Ha az autokatalitikus lépésben részt vevő valamelyik enzimforma koncentrációja lecsökken 1 molekula/össztérfogat alá (vagyis a reakciótérfogatban az adott formából már egyetlen egy molekula sem létezik), akkor az enzim körfolyamata leáll. Nem a reakció tényleges egyensúlyi állapotában, hanem jóval korábban. Ettől az enzim még működőképes marad; ha csak egyetlen „elfogyott” enzimformát elhelyezünk, vagy a reakció irányát megfordítjuk (esetünkben a gázok cseréjével), a reakció újra folytatódni fog. Azt, hogy az autokatalitikus lépésben részt vevő enzimforma elfogyása mikor következik be, az egyéb enzimformák közötti átmenetek sebességi állandói fogják meghatározni. Ez az idő függeni fog az egyes enzimformák koncentrációjától, ezen keresztül a teljes enzimkoncentrációtól is. Minél több enzimünk van, annál később következik be a körfolyamat megszakadása, így annál több termék keletkezik. A látszólagos egyensúly tehát függeni fog az enzimkoncentrációtól.

A hidrogenáz egyedi enzim,
vagy van még ilyen több is?

Autokatalitikus folyamatban alakulnak ki a prionfehérjék ártalmas formái is, de ezek nem enzimek. Olyan enzim, melyet a működtetése előtt aktiválni kell, több is ismert. Olyan is van, melyet pontosan ugyanolyan reakcióban kell aktiválni (ezért autokatalitikus a reakció), amilyen reakciót ő maga is katalizál (illetve katalizálna, ha már aktív lenne). Ilyenek például a különböző foszforiláz enzimek.

Olyan enzim azonban, amely az enzimciklusában tartalmaz egy autokatalitikus lépést, eddig nem volt ismert. Kísérletileg csak a hidrogenázok esetében bizonyított, hogy egy ilyen lépés magában az enzimciklusban létezik, s ez munkacsoportunk eredménye. Egyéb enzimekről fellelhető irodalmi adatok arra utalnak, hogy más enzimek esetében is létezhet ez a jelenség. Érdekes, hogy minden ilyen gyanús esetben a katalizált reakcióban valamilyen gáz is szerepel. Ilyen például a CO dehidrogenáz nevű enzim, mely a szén-monoxidból a víz oxigénje segítségével szén-dioxidot képez, miközben protonok és elektronok keletkeznek. Itt megfigyelték a hosszú lag fázist. Szulfid-kinon-oxidoreduktáz esetében (ez a kénhidrogént bontja le), a hosszú lag fázist és a koncentrációfüggést is kimutatták.

A jelenség tehát nem egyedi. Az autokatalitikus lépés részletei azonban még nem ismertek. Nem tudjuk, mi történik, de gyanítjuk, hogy az enzimben egy kis konformációváltozás történik (kicsit megváltozik a szerkezete, elcsavarodik, meggörbül stb.). Ennek felfedezése, a részletek megértése adják az elkövetkező évek feladatait.
 

Kulcsszavak: autokatalitikus reakció, enzimaktivitás, hidrogenáz