a jelzőmolekulát. A karakterisztikus fragmensionok
alapján a módosulás helye a szekvenciában pontosan lokalizálható, és
lehetőség nyílik az egyes módosulási pontok nagy érzékenységű,
kvantitatív meghatározására is. Nagy felbontású LC-MS vizsgálataink
(Waters Q-TOF Premier) szerint a keletkező CPM–peptid adduktok
mellett több melléktermék is azonosítható, amelyek több csúcsban
jelennek meg a kromatogramokban. Azonosítottuk a ciklikus peptidek
tioéter-, illetve oxidált triptofánt tartalmazó származékait (több
csúcsban) (Mozziconacci et al., 2010); a ciklikus peptideket,
illetve a peptidek dimerjeit; a CPM-peptid adduktok szerkezeti
izomerjeit (több csúcsban).
NMR-spektroszkópiával azért vizsgáltuk a ciklikus
modellpeptidek térszerkezetét, hogy meghatározzuk az oldatbeli
konformerekben a fotolitikus viselkedés szempontjából fontosnak vélt
Trp–SS távolságot. A peptideknél szokásos NMR jelhozzárendelési és
szerkezetmeghatározási stratégiát követve, kétdimenziós (2D)
kísérletek (1H-1H COSY, TOCSY, ROESY és 1H-13C HSQC) sorozatát
végeztük 500 MHz protonfrekvencián. A ROESY-spektrumok alapján
nyert, molekulán belüli proton–proton távolságok felhasználásával az
energiaminimalizált szerkezetek sokaságát kaptuk, amelyekből
reprezentatív konformereket választottunk ki. A további
szerkezetfinomításhoz, valamint a másodlagos szerkezeti elemek
statisztikai értékeléséhez molekuladinamikai számításokat végeztünk.
A másodlagos szerkezetet stabilizáló hidrogénkötések jelenlétét az
amidprotonok kémiai eltolódásának hőmérsékletfüggése alapján
igazoltuk. Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy ugyan a kapott
konformerek hasonlóak, de kisebb különbségek mutatkoznak –
feltehetőleg a másodlagos szerkezetek eltérő arányának
tulajdoníthatóan – mind a főlánc konformációjában, mind a flexibilis
oldalláncok elhelyezkedésében. A fotolízis szempontjából fontosnak
gondolt triptofán-diszulfidhíd (W-SS) és triptofán-lizin (W-K)
oldalláncok közötti távolságok előfordulási valószínűsége a
konformerek sokaságában a 2.
táblázatban van összesítve. A kapott értékek összhangban
vannak az MM-számítások eredményével.
ESR-spektroszkópiai vizsgálatokat végeztünk annak
érdekében, hogy az UV-besugárzás hatására felszakadó
diszulfidhidakból keletkező tiil-gyököket csapdázzuk. Méréseinkben a
szabadgyök befogására 5-(dietoxifoszforil)-5-metil-1-pirrolin-N-oxid
(DEPMPO) vegyületet használtunk, UVB- (280–320 nm) és UVA-tartományú
(320–380nm) besugárzás mellett, DTPA-t tartalmazó foszfátpufferben
(pH~7,4). Eredményeink azt mutatják, hogy még az argongázzal
oxigénmentesített pufferoldatokban is számolni kell olyan
fotodisszociációkkal, melyek hidroxil-gyökök képződéséhez vezetnek.
A diszulfidhidakat tartalmazó peptidek gyökös fotodisszociációjakor,
a vizes oldatokban képződő szulfhidrilcsoportok mint redukálószerek,
hatékonyan redukálják a DEPMPO-val képződött
nitroxid-szabadgyököket, amelyek EPR-inaktív hidroxilaminokat
eredményeznek. A keletkező hidroxilaminokat K3Fe(CN)6 mint enyhe
oxidálószer segítségével visszaoxidálva a csapdázott gyökök között
elsősorban hidroxilgyökök, illetve széncentrumú szabadgyökök
detektálhatók. Ezek kvantitatív meghatározása azonban csak további
részletes mérések alapján lehetséges.
• Eredményeink azt mutatják, hogy a tandem
tömegspektrometria mint módszer, a CPM-jelzőmolekula segítségével
alkalmas a kvantitatív szulfhidril-tartalom meghatározására.
• Az ESR-spektroszkópiai eredményeink jelzik a
diszulfidhidak felszakadása következtében keletkező
szabadgyök-képződést, de a tiil-gyökök kvantitatív mérése csak
további vizsgálatok alapján lehetséges.
• Figyelembe véve a modell peptidek térszerkezetét
és a fotolízisük eredményeit, úgy tűnik, hogy kistagszámú peptidek
esetében a W–SS távolságnak nincsen meghatározó szerepe az UVB
sugárzás hatására lejátszódó fotolízisben. Ennek bizonyításához más
modellek (a ciklikus modellekben W helyett Y, F, V aminosav) teljes
körű konformáció- és fotolízis-vizsgálata, valamint a fotolízis
termékeinek további analízise szükséges.
A kutatás az OTKA (K 100720 M. Zs., K 105459 K. K.) és az
MTA–MedInProt támogatásával valósult meg. Dr. Schlosser Gitta és Dr.
Borics Attila munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatta.
Kulcsszavak: ciklopeptidek, diszulfidhíd, fotolízis,
szulfhidrilcsoport, fluoreszcencia, tandem tömegspektrometria,
LC-MS/MS, NMR-spektroszkópia, szabadgyök-csapdázás,
ESR-spektroszkópia
HIVATKOZÁSOK
Ayers, Frank C. – Warner, G. L. – Smith,
K. L. – Lawrencem D. A. (1986): Fluorometric Quantitation of
Cellular and Nonprotein Thiols. Analytical Biochemistry.
154, 186–193. DOI:10.1016/0003-2697(86)90513-0
Illyés Eszter – Staelens, S. – Vanhooren,
A. – Deckmyn, H. – Hanssen, I. – Majer Zs. (2014): Role of the
Trp-disulfide Triads in the UV Light Induced Degradation of a
Monoclonal Antibody scFv. International Journal of Biochemistry
Research & Review. 4, 5, 367–385. DOI:10.9734/IJBCRR/2014/8453 •
WEBCÍM
Mozziconacci, Olivier – Kerwin, B. A. –
Schöneich, C. J. (2010): Photolysis of an Intrachain Peptide
Disulfide Bond: Primary and Secondary Processes, Formation of H2S,
and Hydrogen Transfer Reactions. The Journal of Physical Chemistry.
B. 114, 3668– 3688. DOI: 10.1021/jp910789x
Sletten, Ellen M. – Bertozzi, Carolyn R.
(2009): Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of
Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48,
6974–6338. DOI: 10.1002/anie.200900942 •
WEBCÍM
Vanhooren, Ann – Illyés E. – Majer Zs. –
Hanssens, I. (2006): Fluorescence Contributions of Individual Trp
Residues in Goat a-lactalbumin. Biochimica et Biophysica Acta -
Proteins and Proteomics. 1764, 1586–1591.
DOI:10.1016/j.bbapap.2006.07.011 •
WEBCÍM
|