Bevezetés

A biológia történeti tudomány. A biológiai rendszerek szerkezete, a fehérjéktől egészen az ökoszisztémákig mind egy hosszú, több mint hárommilliárd évvel ezelőtt kezdődött evolúciós folyamat eredménye. Bár az evolúció folyamatainak és múltbeli lefolyásának tanulmányozását hagyományosan a többi biológiai diszciplínától különállóként kezelték, az a gondolat, hogy az élet története kulcsfontosságú az élő rendszerek megértésében, mára kezd széles körben elfogadottá válni.

A DNS-láncok nukleotidsorozatának megfejtésére kidolgozott technológiák rohamos fejlődése alapjaiban változtatta meg a biológia forrásait és kérdéseit. Különösen igaz ez az élővilág történetének kutatására. A DNS-szekvenciák hiányában néhány évtizede még a fajok származását, őseik testfelépítését és életmódját a ma élő egyedek közös és eltérő tulajdonságai, valamint fennmaradt fosszíliák alapján próbáltuk meg felderíteni. Ma már a fajok teljes genetikai állománya és ezáltal az őseiktől örökölt gének közötti hasonlóságok és különbségek sokasága áll rendelkezésünkre. Ezek a DNS-szekvenciák a múlt dokumentumai (Zuckerkandl – Pauling, 1965; Boussau et al., 2010), amelyek segítségével minden eddiginél részletesebben rekonstruálhatjuk az élet történetét és érthetjük meg ma fellelhető diverzitását.

A szekvenálástól a géncsaládokig

Az örökítőanyag minden egyes szaporodási ciklusban megkettőződik, így adódik tovább (kisebb-nagyobb másolási hibákkal, mutációkkal) az utódoknak, akik azt saját utódaiknak örökítik, újabb módosulásokkal. Ily módon kerül a DNS-láncok nukleotid sorozatába, a DNS-szekvenciákba az élőlények leszármazási történetének lenyomata. A molekuláris filogenetika feladata, hogy csupán egyetlen jelenbeli pillanatképből, a laboratóriumban megfejtett szekvenciák közötti különbségekből kikövetkeztesse ennek a folyamatnak a lépéseit, rekonstruálja a hozzájuk vezető osztódások sorozatát.

Ezekből a pillanatképekből azonban nagyon sok áll rendelkezésünkre, mára több tízezer élőlény teljes genetikai állománya (genomja) ismert. Az evolúciós múlt DNS-szekvenciák alapján történő rekonstrukciójában az első feladatunk, hogy a genomszekvenciákat, amelyek önmagukban csak a négy nukleotidból (A, T, G, C) álló hosszú sorozatok, valamilyen módon értelmezzük. Ezt a genomok automatizált számítógépes elemzése segítségével (annotálásával) tesszük. Ennek a folyamatnak kulcsfontosságú lépése a gének predikciója.

A filogenetikai rekonstrukció elemi egységének ugyanis a fehérjéket (és más funkcionális makromolekulákat, például riboszomális vagy transzfer-RNS-eket) kódoló géneket tekintjük. Ennek az oka az, hogy ezekre a szekvenciákra olyan funkcionális egységekként gondolunk, amelyekről jó közelítéssel feltételezhetjük, hogy részei (végső soron az egyes nukleotidok) közös evolúciós történettel rendelkeznek.

A rekonstrukció következő lépése, hogy a génszekvenciák tömegében megkeressük a gének olyan homológ csoportjait, melyek minden tagja egyértelműen közös eredetű a csoport többi tagjával (Boussau et al., 2010). Egy-egy ilyen homológ csoport, egy géncsalád általában több különböző faj hasonló funkcióval rendelkező génjeit tömöríti. Ilyen például a citokróm-c fehérjét kódoló gének családja. Előfordul, hogy ugyanazon faj két vagy több rokon génje is megtalálható egy „többpéldányos” családban: erre példa az emberi hemoglobin oldalláncok családja.

Hogy az egy géncsaládba tartozó szekvenciák közötti különbségeket megtaláljuk, meg kell tudnunk mondani, hogy egy adott génben melyik nukleotid melyik másik nukleotidnak feleltethető meg a család többi génjében. Ehhez egy ún. szekvenciaillesztési (1. ábra) táblázatban a szekvenciákat egymás alá írjuk úgy, hogy a táblázat egyes oszlopaiba kerüljenek azok a szekvenciapozíciók, melyek a géncsalád közös ősi szekvenciájában ugyanazon szekvenciapozícióra vezetik vissza történetüket. A szekvenciaillesztés nehézsége abban rejlik, hogy a szekvenciák evolúciója során kisebb-nagyobb szekvenciabeszúrások és -kivágások történhettek. Ennek eredményeképpen a géncsalád szekvenciái általában különböző hosszúságúak, és mivel a szekvenciabeszúrások és -kivágások történét a priori nem ismerjük, nagyon sok szekvenciaillesztési táblázat lehetséges. Ezt a problémát a gyakorlatban úgy oldjuk meg, hogy azt a táblázatot választjuk, amely a lehető legkevesebb törés beiktatásával illeszti a lehető leghasonlóbb karaktereket egy oszlopba.

A szekvenciaillesztés birtokában már felvázolhatjuk, milyen események sorozata vezetett a szekvenciák közti különbségek kialakulásához. Ehhez azonban ismernünk és modelleznünk kell a szekvenciát módosító folyamatokat, azaz a nukleotidok cseréjét (szubsztitúcióját), beszúrását és kivágását (inszercióját és delécióját). Az 1. ábrán bemutatott négy rokonszekvencia létrejöttét például a jobb oldali eseménysor magyarázza meg. Itt a fa elágazásai mind egy-egy DNS-replikációs eseménynek felelnek meg, ahonnan a két új szekvencia más-más úton fejlődött tovább, és különböző mutációk létrejöttével eltávolodtak egymástól. Nagyon sok lehetséges evolúciós történet és ezeknek megfelelő génfa létezik, melyek ugyanarra a szekvenciaillesztésben összefoglalt megfigyelésre vezetnek. Ezek közül a legkevesebb eseményt igénylő (szofisztikáltabb matematikai módszereket alkalmazva a legvalószínűbb) génfát a célunk megtalálni.

Az utóbbi évtizedekben a génfa-rekonstrukciós eljárások rohamos tempóban fejlődtek. Mára számos matematikailag kifinomult és biokémiailag jól informált módszer létezik génfák rekonstrukciójára az 1. ábrán illusztrált szekvenciaillesztések alapján (Felsenstein, 2004). A rekonstrukció számára azonban alapvető korlátot szab a rendelkezésre álló szekvenciák, illetve a köztük lévő különbségek végessége, valamint távolabbi rokonszekvenciák esetén az evolúciós múlt évmilliárdos távlatai. Ennek eredményeként a génfa-rekonstrukció az egyedi géncsaládok szintjén jellemzően több, részben hasonló génfával is hasonlóan jól megoldható, ezért csak egy valamelyest elmosódott képet ad a géncsalád evolúciós történetéről.

Minden géncsalád története egyedi

Emil Zuckerkandl és Linus Pauling ötven éve publikálta az első molekuláris szekvenciák alapján készült génfa-rekonstrukciót a béta-típusú globinok családjáról. Ennek a géncsaládnak az emberi genomban több tagja van, amelyek különböző életszakaszokban aktivizálódnak, hogy legyártódhasson belőlük az adott életkorban a megfelelő hemoglobin alegység. Zuckerkandl és Pauling három emberi hemoglobin gén – a magzati korban jelenlévő γ-globin, valamint a felnőttekre jellemző β- és δ-globin – szekvenciáját hasonlította össze a ló, és két szarvasmarha megfelelő génjeivel. Zuckerkandl és Pauling rekonstrukciójának eredménye a 2. ábra bal oldalán látható.

Ha ezt alaposabban szemügyre vesszük, feltűnik, hogy a család humán, szarvasmarha és ló genomokból származó tagjai nem olyan rokoni kapcsolatban állnak egymással, mint amire számíthatnánk – a β- és δ-globinokat tekintve az ember a ló közelebbi rokonának tűnik, mint a szarvasmarha. Ha a γ alegységeket is megfigyeljük, még bonyolultabbnak tűnik a helyzet. Téves lenne tehát Zuckerkandl és Pauling híres munkája? Nos, a válasz korántsem ilyen egyszerű: ahhoz, hogy megértsük, hogyan lehet pontos egyszerre az itt látott β-globin fa, és a számításba vett három faj jól ismert rokonsági kapcsolata is, a szemléletünkön kell változtatnunk.

A 2. ábra jobb oldalán található, vastag körvonalú „csőrendszer” a kérdéses három faj leszármazási kapcsolatait ábrázolja: ez fajfa, amelynek elágazásai ősi fajképződési eseményeket jelölnek. A génfák általában a fajfát követik, hiszen a fajképződések során a keletkező két új faj a közös ős génjeit örökli. A gének sorsa viszont ennél bonyolultabban is alakulhat: végbemehet például a duplikáció, egy ritka esemény, amelyet követően a faj genomjában a duplikálódott gén két, eleinte azonos szekvenciájú példánya lesz jelen. Duplikációs eseményeket követően a génfa elágazik, két új ágban fejlődik tovább. Hasonlóan megtörténhet, hogy a faj elveszti az adott gén egy példányát, ebben az esetben a génfa érintett vonala nem ér el a jelenig (Maddison, 1997). Duplikációk és génvesztések sorozatát feltételezve Zuckerkandl és Pauling génfáját is bele tudjuk rajzolni a fajfába, mint ahogy az ábrán látható.

Ma már ismert, hogy főként prokarióta, de néha eukarióta fajok között is előfordul a horizontális géntranszfer – erre kiváló példa a mitokondrium és a kloroplasztisz génjeinek bekerülése az eukarióta sejtmagba (endoszimbiotikus géntranszfer). Egy ilyen esemény azt eredményezi, hogy a génfa vonalai a fajfa ágaira merőlegesen haladnak, és átlépik a távolabbi rokon fajok közötti határokat is (3. ábra), ezzel tovább gazdagítva a lehetséges génfa-berajzolások halmazát.

Úton a pontosabb faj- és géntörténetek felé

Mint azt fentebb is említettük, a géncsaládok szekvenciája alapján rekonstruált gének gyakran elmosódottak. Ha a fajfát ismerjük, vagy ismertnek tételezzük fel, nagy mértékben csökkenteni tudjuk ezt az elmosódottságot. Ekkor ugyanis a lehetséges génfák közül nem csak aszerint tudunk választani, hogy melyeket feltételezve van szükségünk a legkevesebb szubsztitúcióra (vö. 1. ábra), hanem az alapján is, melyik génfa magyarázható kisebb számú duplikáció, horizontális géntranszfer és génvesztés segítségével. A 2. ábra példája esetén is ez a helyzet, kiderül ugyanis, hogy a fajfa ismeretében egy alternatív génfa lesz a legvalószínűbb, amelynek a fajfába való berajzolásához kevesebb duplikáció- és génvesztés-eseményre van szükség.

De honnan tudjuk, hogyan néz ki a fajfa? A β-globinokon kívül géncsaládok millióit ismerjük. Ezek közül azokban a géncsaládokban, amelyekben duplikáció-, génvesztés- vagy transzferesemények mentek végbe, azt várjuk, hogy a génfa különböző lesz a fajfától. Valójában a géncsaládok szinte mindegyike ebbe a kategóriába sorolható, olyan eszenciális géncsaládok ritka kivételével, amelyek hiánya drasztikus következményekkel jár az élőlények számára – ilyen például az információkezeléssel (transzkripció, transzláció) foglalkozó gének egy része. Amennyiben egy ilyen géncsalád tagjai pontosan egy példányban szerepelnek minden élőlény genomjában, és feltételezzük, hogy nem történt egyetlen génduplikáció, horizontális géntranszfer vagy génvesztés-esemény sem, akkor a géncsalád története, pontosabban az azt leíró génfa megegyezik az őket hordozó fajok történelmével, vagyis az azt leíró fajfával. 1977-ben Carl Woese és társai (Fox et al., 1977) is egy ilyen „egypéldányos” géncsalád, a riboszómák alkotórészét adó kis RNS-alegység, az ún. 16S rRNS gének szekvenciáit vizsgálva rekonstruálták az élővilág fajfáját, és fedezték fel, hogy az addig prokariótaként ismert csoport valójában két doménre oszlik: a baktériumokra és archeákra.

Célravezetőnek tűnhet tehát, hogy a kis számú esszenciális géncsaládot, a gének „1%”-át felhasználva kövessük vissza az élet történetét. Azonban ha így járunk el, a géncsaládok maradék 99%-a által hordozott információt nem hasznosítjuk. Ez azt eredményezi, hogy az egyedi géncsaládok történetének elmosódottsága miatt sok esetben nem rajzolható fel egyértelműen a fajfa sem.

Erre a problémára keresték a megoldást Bastien Boussau és munkatársai, akik 2013-ban harminchat emlősfajban 6966 géncsalád történetét rekonstruálták a fajfával közösen. A lehetséges fajfák terét egy számítógépes algoritmus segítségével járták be: egy adott fajfára elkészítették az összes géncsaládhoz tartozó, az adott fajfához és a szekvenciákhoz együttesen legjobban illő, mindkét folyamat szerint legvalószínűbb génfát. Az így kapott „közös” valószínűségek szorzata adta a fajfa valószínűségét. Ezt követően minden szomszédos fajfára is elvégezték ugyanezt a számítást, és ha ezek között találtak olyan szomszédot, melynek valószínűsége nagyobb volt, mint a kezdeti fajfa, akkor az eljárást ettől a fajfától elindulva megismételték. Az algoritmus akkor ért véget, amikor olyan fajfát találtak, amelynek nem volt szomszédja, amely nála valószínűbb lett volna. Ez az eljárás egyszerre használja a fajfa adta keretrendszert arra, hogy pontosabb génfákat kapjunk, miközben a fajfát is nagy pontossággal, több ezer géncsalád alapján képes meghatározni — ez az ún. közös rekonstrukció. Az eredmények biztatóak: a kapott fajfa nem mond ellent semmilyen ismert rendszertani ténynek, és a géntörténetek is valószerűek, ugyanis nem mutatnak a mainál jóval nagyobb ősi genomokat (nem megfelelő rekonstrukciós módszerek gyakran vezetnek „felduzzasztott” ősi genomokhoz).

Géntranszfer: zaj helyett információ

Az emlősök történetének kutatásában elegendő csupán a duplikációkat és a génvesztéseket figyelembe vennünk, más élőlényeknél viszont nem hanyagolható el a gének történetét bonyolító harmadik folyamat sem: a horizontális géntranszfer. A transzfereseményekre sokan a fajfa vonalait elmosó „zajként” tekintenek, hiszen ilyenkor a génfák vonalai átlépik a fajok szabta határokat, és a fajfa csöveinek összekötésével egy bonyolult hálózatot hoznak létre. Ha azonban mégis arra vállalkozunk, hogy megvizsgáljuk a transzferen keresztülment géncsaládok történetét is, értékes információkhoz juthatunk.

Először is figyelembe kell vennünk, hogy minden transzfer két, térben és időben egymás mellett élő faj között történhet meg – fordított szemszögből nézve, ha ismerünk egy transzfert is tartalmazó géntörténetet, megtudhatjuk, a fajfa mely ágai fedtek át egymással időben (3. ábra). Több transzfert felhasználva akár a fajfa összes elágazásának idejét is meghatározhatjuk (Szöllősi et al., 2012).

Ugyanilyen jelentőséggel bírhat a tény, hogy az ősi horizontális transzferek során mára már kihalt fajok génjei is bekerülhettek a mostani élőlények őseinek genomjába. Ha ezek a gének beépültek az új genomba, és ott egészen napjainkig fennmaradtak, akkor az élővilág számunkra eddig ismeretlen részeinek lenyomatát adhatják (Szöllősi et al., 2013).

A múlt életre kel a laboratóriumban

A filogenetikai rekonstrukció eredménye nemcsak egy génfa, hanem, mint az az 1. ábrán is látható, a szekvenciaváltozásokat a génfa mentén visszafelé követve az ősi szekvenciákat is megkapjuk. Ugyanazon szekvenciaillesztés esetén különböző alternatív génfák különböző ősi szekvenciákhoz vezetnek. Ezek az ősi szekvenciák az evolúciós múltról tett alternatív predikciók, amelyeket a laboratóriumban egymással összehasonlíthatunk. Rendelkezésünkre állnak ugyanis molekuláris biológiai módszerek, melyek segítségével az ősi szekvenciákat mesterségesen szintetizálva, majd baktériumokba bejuttatva az általuk kódolt ősi fehérjéket is legyárthatjuk.

Mathieu Groussin és társai (Groussin et al., 2015) ilyen módon „feltámasztott,” több száz millió éves LeuB-enzimek biokémiai tulajdonságait hasonlították össze. Arra az eredményre jutottak, hogy mind a fajfa figyelembe vételével, mind pedig az anélkül rekonstruált génfáknak megfelelő enzim nagy vonalakban hasonló enzimeket eredményezett: mindkettő a mai LeuB-enzimeknél magasabb hőmérsékleten működött optimálisan, megerősítve azt, hogy az ősi baktérium, amelyből származtak, magas hőmérsékleteken élő, ún. termofil organizmus volt. A részletesebb enzimatikus aktivitásra irányuló vizsgálatok azonban egyértelműen kimutatták, hogy csak a fajfa felhasználásával rekonstruált enzim mutatott a jelenbeli enzimekkel összemérhető, valószerű biokémiai paramétereket.

A LeuB-enzimekkel végzett kísérletek közvetlen bizonyítékát adják annak, hogy a fajfa és génfák közös kezelésével pontosabb rekonstrukciókat kapunk. Megmutatják továbbá, hogy nemcsak a fajok és gének leszármazásának történetéről lehet élesebb fogalmunk, hanem az ősi enzimekről és rajtuk keresztül az ősi élőlények tulajdonságairól is részletes információkhoz juthatunk.
 

Kulcsszavak: DNS-szekvenálás, génduplikáció, horizontális géntranszfer, szekvenciaillesztés, génfák, fajfák
 

IRODALOM

Boussau, Bastien – Szöllősi Gergely J. – Duret, Laurent et al. (2013): Genome-scale Coestimation of Species and Gene Trees. Genome Research. 23, 2, 323–330. DOI: 10.1101/ gr.141978.112 • WEBCÍM

Boussau, Bastien – Daubin, Vincent (2010): Genomes as Documents of Evolutionary History. Trends in Ecology and Evolution. 25, 4, 224–232. DOI: 10.1016/j.tree. 2009.09.007

Felsenstein, Joseph (2004): Inferring Phylogenies. Sinauer Associates, Sunderland, USA

Fox, George E. – Magrum, Linda J. – Balch, William E. et al. (1977): Classification of Methanogenic Bacteria by 16S Ribosomal RNA Characterization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 74, 10, 4537–4541. DOI: 10.1073/ pnas.74.10. 4537 • WEBCÍM

Groussin, Mathieu – Hobbs, Joanne K. – Szöllősi Gergely J. et al. (2015): Toward More Accurate Ancestral Protein Genotype–Phenotype Reconstructions with the Use of Species Tree-aware Gene Trees. Molecular Biology and Evolution. 32, 1, 13–22. DOI: 10.1093/ molbev/msu305

Maddison, Wayne P. (1997): Gene Trees in Species Trees. Systematic Biology. 46, 3, 523–536. DOI: 10.1093/sysbio/46.3.523 • WEBCÍM

Szöllősi Gergely J. – Tannier, Eric – Lartillot, Nicolas – Daubin, Vincent (2013): Lateral Gene Transfer from the Dead. Systematic Biology. 62, 3, 386–397. DOI: 10.1093/sysbio/syt003 • WEBCÍM

Szöllősi Gergely J. – Boussau, Bastien – Abby, Sophie S. et al. (2012): Phylogenetic Modeling of Lateral Gene Transfer Reconstructs the Pattern and Relative Timing of Speciations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109, 43, 17513–17518. DOI: 10.1073/pnas.1202997109 • WEBCÍM

Zuckerkandl, Emile – Pauling, Linus (1965): Evolutionary Divergence and Convergence in Proteins. Evolving Genes and Proteins. 97, 97–165. • WEBCÍM

Zuckerkandl, Emile – Pauling, Linus (1965): Molecules as Documents of Evolutionary History. Journal of Theoretical Biology. 8, 2, 357–366. DOI: 110.1016/0022-5193(65)90083-4 • WEBCÍM