Bevezetés

A tumorok növekedésének elengedhetetlen feltétele, hogy csatlakozzanak a vérérhálózathoz mint oxigén- és egyéb tápanyagforráshoz. A tumor növekedésekor leggyakrabban érújdonképződést indukál, ami a meglévő erekből ered, és így biztosítja a kapcsolódást a keringéshez. A tumor méretének növekedésével hipoxiássá válik, és termelni kezd olyan faktorokat (VEGF, FGF2), melyek az angiogenezist serkentik. Az endotélsejtek osztódni kezdenek a tumor közvetlen közelében, és benyomulhatnak a tumorba. Ám az így létrejött erek különböznek a normális erektől; általában permeábilisabbak a normálisnál, és zsákutcaszerűen végződve keveredik bennük az artériás és a vénás vér (Vaupel, 1998).

Az igény már korán megfogalmazódott az angiogenezis biokémiájának megértésére. Ismert jelenség a klinikumban, hogy az elsődleges tumor eltávolítását követően indul meg a metasztázisok kialakulása. Ezt kezdetben az elégtelen műtéti beavatkozásnak rótták fel. Mára már elfogadottá vált, hogy a még nem erezett mikrometasztázisok jelenléte esetében az elsődleges tumor által termelt faktorok gátolják ezek növekedését, aminek alapja be nem ereződésük. Judah Folkman és munkatársai felfedezték, hogy a primer tumor két olyan faktort (angiosztatin és endosztatin) termelhet, amellyel gátolja a mikrometasztázisok növekedését (O’Reilly et al., 1994, 1997). Az angiosztatint főként a tumor sztroma termeli, kontrollálva a metasztatizált sejtek osztódását. Állatkísérletek megerősítették ezt a megfigyelést, mert az exogén angiosztatin nyugalmi állapotban tudta tartani az indukált tumorgócokat. Későbbiekben számos mátrix fehérje degradációs termékéről derült ki, hogy angiogenezist gátló fiziológiás inhibitor kapacitással rendelkeznek.

A tumorindukált angiogenezis folyamata
az áttétképzésben

A keringő daganatsejtek a célszervbe érve az érfalhoz tapadnak ki, ahol lokálisan fibrinrögök/-háló keletkezik. Ez egy nagyon fontos momentum, mert így mintegy álcázza magát a daganatsejt az immunrendszer elől, és az extracelluláris mátrix és/vagy a bazális membrán feloldásával olyan folyamatok stimulálódnak, melyek eredménye az, hogy az endotélsejtek visszanyerik migrációs képességüket, megindulnak a sztroma felé, és eközben osztódnak, kialakítva az új eret. Az érfal kialakulásáig ez a folyamat támadható sejtosztódást gátló ágensekkel. Az utolsó lépés a véredény-kialakításban a periciták megjelenése mely stabilizálja az endotél tubust. Látható tehát, hogy az érújdonképződés gátlása fontos eszköz lehet a daganatellenes terápiában. Előnye, hogy széles spektrumú, a legkülönbözőbb eredetű tumorok ellen is hatásos lehet. Hogy az elv mennyire átültethető a gyakorlatba, azt bizonyítja az elmúlt öt évben törzskönyvezett angiogenezis-moduláló gyógyszerek sora.

Az angiogenezis fiziológiás gátlása

Az angiosztatin egy nagyobb fehérjének, a plazminogén/plazminnak proteolitikus terméke. A plazmin a fibrinolízis fő enzime, mely a fibrinrög oldásában vesz részt, lebontva a fibrinszálakat. A plazminogén/plazmin N-terminális részén található öt, ujjszerű, fibrinfelismerő domain, amit a szakirodalom kringle-nek nevez (1. ábra). Ebből gyakrabban az 1–3., ritkábban az 1–4. kringle-ket tekintik angiosztatinnak, de az 5. kringle-nek is van angiosztatikus hatása.

1. ábra • Egy kringle modul szerkezete.

A bekarikázott részek a kénhidak.

Az angiosztatin rövid életű polipeptid, féléletideje kb. 15 perc, és főként ebben rejlik terápiás célú alkalmazásának nehézsége. Az angiosztatin számos úton keletkezhet. A legkézenfekvőbb az autokatalízis, amikor az aktív plazmin szabadítja fel, de a plazminogénről különböző proteázok is lehasíthatják: mátrix metallo-proteázok (MMP-k), prosztataspecifikus antigén (PSA), 13 kDa szerin proteáz, 24 kDa endopeptidáz, elasztáz, kallikrein és katepszin (stb.).

Az angiosztatin hatásmechanizmusa

Habár az angiosztatin a plazmin/plazminogén fehérje része, eltérő receptorokhoz kötődik. Az angiosztatin esetében ezidáig három kötőfehérjét azonosítottak: az ATP-szintáz-t, az angiomotint és az avb3 integrint. Az ATP-szintáz azért meglepő, mert eddig főként mitokondriális jelenlétét írták le, azonban egyre gyakrabban figyelnek meg ektopikusan mitokondrium-specifikus enzimeket. Az angiomotint 2001-ben írták le, ez egy PDZ-fehérje, és szerepe van az endotél sejtek migrációjában. Az integrin receptorok közül az avb3, a9b1 és kisebb affinitással az a4b1 specifikusan köti a kringle-ket, de sem a plazminogénhez, sem a plazminhoz nincs szignifikáns affinitásuk. Érdekes: a kölcsönhatást RGD-peptiddel blokkolni lehet, noha a kringle-k nem tartalmazzák az RGD-szekvenciát.

A kringle-k szerkezetileg hasonlóak bizonyos növekedési faktorokhoz, így például a HGF-hez (hepatocita növekedési faktor), ami tartalmaz kringle-szerű domaineket, és konzervált aminosav-motívumokat. Így nem meglepő, hogy az angiosztatin kringle-k interferálnak a HGF-el a c-met/HGF-receptorhoz történő kötődéskor, ezért az angiosztatin leszoríthatónak bizonyult a c-met receptorról fölöslegben adott HGF-fel.

Megoldások az angiosztatin
in vivo termelésére

Az angiosztatin rövid féléletideje (~15 perc) miatt in vitro termeltetése nem gazdaságos. A bakteriális fermentáció a kénhidak miatt nehézkes. Tehát az in vivo és lehetőleg az in situ expressziója lenne kívánatos rövid turnover ciklusa miatt, tehát a forszírozott aktiválás fokozhatná az aktív fehérjemennyiséget. Elképzelésünk szerint egy proteáz – kringle kimérafehérje – teljesíthetné ezeket az elvárásokat. Vagyis a kringle fehérjéket kódoló DNS-t összeépítenénk a megfelelő proteázt kódoló DNS-fragmenttel, létrehozva egy eddig nem létező enzimet, melynek kontrollálható az autokatalitikus hatása. Ezen túlmenően, ha figyelembe vesszük proteázunk sajátosságait, akkor egy megfelelően megválasztott proteáz esetében, amely rendelkezik fibrinolitikus tulajdonsággal is, újabb támadási pontot tudnánk alkalmazni a keringésben lévő vagy a metasztatizálási folyamat korai fázisában lévő daganatsejtgócokkal szemben, mert a kringle-k biztosítják a fibrinkötődést, és az enzim koncentráltan degradálhatná a metasztázisok letapadási pontján kialakuló fibrinhálót, ezzel lehetőséget biztosítva az immunrendszernek a beavatkozásra. Az eddigi in vitro daganatsejtes kísérletek megerősítették elvárásainkat, és igazolták, hogy az ilyen konstrukció gátolja az endotél sejtek migrációját és a VEGF-indukálta endotél proliferációt. Állatkísérletekben a konstrukció in vivo expressziója gátolta a daganatnövekedést a korai fázisban.

Expressziós lehetőségek

Mivel ez egy génterápiás megközelítés, ezért további expressziós szabályozási lehetőséget biztosíthatunk egy megfelelően választott promoterrel. A génbevitelnél használhatjuk a standard génbeviteli eljárásokat, vagyis lipofektint, vagy ezzel ekvivalens nukleinsavbevivő ágenseket. Ebben az esetben a tumorban, vagy közvetlen közelében történne a transzfekció. Jelenleg ennek optimalizálásán dolgozunk. Egy esetleges vírusvektor használatát, amennyiben bizonyítottan biztonságos, megfontolhatjuk. Azonban a fő alkalmazási módot a kombinált őssejtterápiában látjuk. Őssejtek azok a szomatikus sejtek, amelyek megőrizték osztódási képességüket, ami a differenciálódás során szükségszerűen elvész. Felosztásuk többféle szempont alapján történhet. A csontvelői őssejtek egy csoportja, a mezenhimális őssejtek képesek specifikusan a tumoros gócokhoz migrálni, és azokba beépülni. Tehát alkalmazásuk kecsegtetőnek tűnik egy irányított rákterápia kidolgozásakor. A csontvelői hematopoetikus őssejtek szintén szóba jöhetnek, mint lehetséges expresszáló gazdasejtek. Munkánkat az ösztönzi, hogy az USA-ban az FDA már engedélyezett egy hasonló elrendezésű, kombinált őssejtes terápián alapuló vizsgálatot. Az itt bemutatott molekula szabadalmaztatása egy időben kezdődött az Európai Unió (EPO) és az USA szellemi tulajdon védelmével foglalkozó hivatalaiban (EP 12155368.9; US 61/598371).
 

IRODALOM

Katona Róbert – Keller-Pintér Anikó – Letoha Tamás –Tímár József – Szilák László (2012): Angiostatin Chimeras and Uses Thereof (EP 12155368.9; US 61/598371).

O’Reilly, M. S. – Boehm, T. – Shing, Y. – Fukai, N. – Vasios, G. – Lane, W.S. – Flynn, E., Birkhead, J.R. – Olsen, B.R. – Folkman, J. (1997): Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cellular Physiology and Biochemistry. 88, 277–85.

O’Reilly, M. S. – Holmgren, L. – Shing, Y. – Chen, C. – Rosenthal, R. A. – Moses, M. – Lane, W. S. – Cao, Y. – Sage, E. H. – Folkman, J. (1994): Angiostatin: A Novel Angiogenesis Inhibitor That Mediates the Suppression of Metastases by a Lewis Lung Carcinoma. Cell. 79, 315–28.

Vaupel, P. – Kallinowski, F. – Okunieff, P. (1998): Blood Flow, Oxygen and Nutrient Supply, and Metabolic Microenviron-ment of Human Tumors. Cancer Research. 49, 6449–6465.