A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok (GFKR) szupercsaládjába nagyszámú receptor tartozik, és az emberi genom egyik legnagyobb (a kódolt fehérjék kb. 3 %-a) családját alkotják. E receptorok többnyire a sejtmembránban helyezkednek el, és a belső környezetből (hormonok, neurotranszmitterek), illetve a külső térből érkező információ (fény, szagok, ízek) közvetítésében vesznek részt (Ferguson, 2001). A receptorok specifikus ligandfelismerő képessége kiváló terápiás célpontot jelent, és klinikai jelentőségüket jelzi, hogy a használatban lévő gyógyszerek többsége e receptorok működését befolyásolja (Ma – Zemmel, 2002). GFKR-ek ligandjuk kötését követően ún. heterotrimerikus G-fehérjéket aktiválnak, majd ennek következtében az adott receptorra jellemző sejten belüli jelpályák indulnak be, melyek kiváltják a sejtválaszt. A ligand kötése következtében azonban egyéb szabályozási mechanizmusok is aktiválódnak. Ide tartozik a deszenzitizáció (a receptor ligand iránti érzékenységének csökkenése), illetve a receptor internalizációja (bejutása a sejt belsejébe). A klasszikus receptorteória szerint a receptorok a működésük során egy aktív és egy inaktív konformációt vehetnek fel. Az agonista ligand a receptor aktív konformációját okozza, míg a receptor nyugalmi állapotában vagy antagonista ligand kötésének hatására inaktív konformációt vesz fel. Az utóbbi években egyértelművé vált, hogy egy adott GFKR-nek több aktív konformációja is létezhet, ezért aktivációjakor többféle jelátviteli folyamat is létrejöhet, melyet egyes agonisták szelektíven befolyásolhatnak (ezt a jelenséget nevezik biased vagy jelátvitel-szelektív agonizmusnak) (Kenakin – Miller, 2010). Az elmúlt években nyilvánvalóvá vált, hogy a más-más receptorkonformációkhoz köthető, eltérő jelátviteli utak és receptorszabályozási útvonalak szelektív, útvonal-specifikus ligandok által befolyásolhatóak. Lehetséges például a receptor internalizációt szelektíven, G-fehérje-aktiválás nélkül elindítani, így a receptor működését leállítani. Ennek ellenkezője is megvalósítható: szelektív ligand alkalmazásával internalizáció és deszenzitizáció nélkül G-fehérje-aktiválást létrehozni, így kisszámú sejtfelszíni receptorral is nagy sejtválaszt lehet elérni.
Számos olyan öröklődő betegséget ismerünk, amelyek hátterében a GFKR-ek mutációja áll. A mutációk hatására a receptor funkciójának elvesztése különböző okokból történhet: gátolt lehet a receptor helyes másodlagos/harmadlagos struktúrájának kialakulása, és ezért a fehérje az endoplazmatikus retikulumban reked, nem jut ki a sejtmembránra; csökkenhet a receptor G-fehérje aktiválásának a képessége; csökkenhet a receptor ligandkötésének affinitása; illetve a receptor internalizációja fokozott, ezért a sejtfelszínen levő receptorok száma csökken. Arra is fény derült, hogy egyes receptormutációk más módon befolyásolhatják az egyes jelátviteli folyamatokat, tehát jelátvitel-szelektív mutációk is léteznek (Rajagopal et al, 2010). Ez új lehetőségeket teremt azoknak a betegségeknek a jobb megértésében és kezelésében, melyeket e receptorok mutációi okoznak. Egyes nem-peptid ligandok, például antagonista (ún. farmakológiai chaperonok) használatával elérhető az is, hogy a mutáció következtében a sejt belsejében elhelyezkedő receptorokat a sejtfelszínre irányítsuk. Az ilyen típusú molekula elősegítheti az endoplazmatikus retikulumból való kijutást a sejtmembránra, de csökkentheti a receptor fokozott eltűnését is a sejtmembránról, így elősegítve a receptor normális működését.

A jelátviteli szelektív ligandok és receptormutációk felvetik annak lehetőségét, hogy e folyamatokban rejlő terápiás lehetőségeket betegséget okozó receptormutációk esetében is megvizsgáljuk. Kísérleteinkben a mutációk által létrejött, a veleszületett nefrogén diabétesz inszipidusz kezelésére alkalmas ligandok feltérképezését célozzuk meg. A betegségben szenvedő betegekre jellemző, hogy normális vagy emelkedett plazma vazopresszin (kilenc aminosavból álló peptidhormon) koncentrációk ellenére sem tudják koncentrálni a vizeletüket. A betegek mindennapi életét a fokozott vizeletürítés (10–20 liter naponta), a fokozott folyadékbevitel és kínzó szomjúság teszi igen nehézzé. A veleszületett nefrogén diabétesz inszipiduszt 90%-ban a vazopresszin receptorának (V2-R) valamilyen mutációja okozza, ami a receptor funkciójának elvesztését eredményezi. Szemben a vazopresszinhiány esetén kialakuló diabétesz inszipidusszal, a nefrogén diabétesz inszipidusz nem kezelhető a vazopresszin hatásának pótlásával. Jelenleg több mint kétszáz V2-R mutánst azonosítottak, amelyek mind nefrogén diabétesz inszipiduszt okozhatnak, de ezek különböző módon okoznak funkcióvesztést (Spanakis et al, 2008). A mutációk egy része (például a frameshift-ek, deléciók), gyakorlatilag a receptor teljes hiányát eredményezik, hiszen csak egy részlegesen elkészült receptor termelődik a sejtben. A betegséget okozó mutációk jelentős része azonban (a V2-R esetében százkét ismert mutáció, az esetek 56%-a) úgynevezett missense mutáció, ami egy-egy aminosav cseréjét eredményezi a fehérjében egy másik aminosavra. A missense V2-R mutációk esetében többféle farmakológiás megoldás merülhet fel. Ha a receptor oly módon károsodott, hogy helytelen harmadlagos szerkezet miatt a sejt nem képes kijuttatni a sejtfelszínre, akkor farmakológiai chaperonokkal segíthetjük a helyes konformáció kialakulását. GFKR-ek esetében olyan sejtpermeábilis antagonisták (tehát receptorhoz kapcsolódni képes molekulák) jöhetnek számításba, melyek a normális konformációt stabilizálják, és elősegítik a receptor kijutását a sejtmembránba, ahol kölcsönhatásba léphet a ligandjával. Más mutációk azt eredményezhetik, hogy ugyan a receptor kijut a sejtfelszínre, de fokozottan deszenzitizálódik, vagy bekerül a sejt belsejébe (internalizálódik), és emiatt a működőképes receptorok száma a sejtmembránban nem elegendő. Ebben az esetben terápiás jelentősége lehet azoknak a jelátvitel-szelektív ligandoknak, melyek G-fehérje aktiválást létrehoznak, de internalizáció/deszenzitizáció szempontjából antagonistaként viselkednek. Néhány mutáció esetében már leírtak hasonló megoldásokat V2-R esetében (Jean-Alphonse et al. 2009). Csökkent G-fehérje-aktiválási képesség esetén a sejtfelszíni receptorszám növelése és/vagy a deszenzitizáció csökkenése részlegesen helyreállíthatja a receptor működését. Mivel a nefrogén diabétesz inszipidusz ritka betegség, és a kórokok között nagyon sokféle mutáció elképzelhető, ezért a terápia egyénre szabott kell legyen, ami figyelembe veszi a funkcióképtelen mutáció tulajdonságait. Ez azt jelenti, hogy meg kell találni azt a vegyületet, amely képes egy adott mutáns receptort funkcióképessé tenni.

Az AT1-R jelátvitel-szelektív agonizmusa

Laboratóriumunkban vizsgáljuk az 1-es típusú angiotenzin receptor (AT1-R) működését. Az AT1-R receptor angiotenzin II (AngII) kötése Gq-fehérje aktivációját okozza, melynek hatására a sejtekben Ca2+-jel és protein-kináz C enzim aktiválódás jön létre. Mindezek mellett az aktivált receptorokhoz β-arresztin fehérjemolekula is kötődik, amely a receptor deszenzitizációját és internalizációját hozza létre (Hunyady – Catt, 2006). Az AT1-R esetében ismerünk egy jelátvitel-szelektív agonistát: a [Sar1, Ile4, Ile8]-AngII-t. A fiziológiás liganddal (az AngII-vel) ellentétben az [Sar1, Ile4, Ile8]-AngII nem okoz G-fehérje-aktivációt, de hatására a receptor képes β-arresztint kötni és internalizálódni, valamint a G-fehérjétől független jelátviteli utak is aktiválódnak (Wei et al, 2003; Szidonya et al, 2007).

A jelátviteli folyamat vizsgálata céljából fúziós és mutáns fehérjéket állítottunk elő standard molekuláris biológiai módszerekkel. A létrehozott konstrukciókat, illetve a mutagenezist tartalmazó cDNS-eket restrikciós emésztéssel azonosítottuk, majd a szekvenciákat DNS-szekvenálással ellenőriztük. A DNS-konstruktokat eukarióta sejtben fehérjekifejeződés létrehozására alkalmas plazmidokba építettük be. A vizsgálni kívánt fehérjéket a sejtkultúrában fenntartott eukarióta sejtvonalakban fejeztük ki. Az immortalizált sejtek tranziens transzfekciója a megfelelő cDNS-t tartalmazó plazmiddal és transzfekciós reagens segítségével történt. A transzfektálást követően a sejtek 24 órán belül kifejezik a vizsgálni kívánt fehérjéket.

Kísérleteinkben biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer (BRET) technikával megvizsgáltuk a receptoraktiváció során az AT1-R megjelenését a sejtmembrán különböző mikrodoménjeiben. A BRET-mérés során egy sejtpermeábilis szubsztrát (coelenterazin) hatására a vizsgált fehérjéhez kapcsolt Renilla luciferáz (lumineszcens energiadonor) fotonokat emittál, mely a két vizsgált fehérje (ún. intermolekuláris szondák) vagy ugyanazon fehérje különböző részei (intramolekuláris szondák) molekuláris szintű (< 100 Å) közelsége esetén energiatranszfert képes kiváltani, amely szintén a vizsgált fehérjéhez kapcsolt YFP (energiaakceptor) fényemisszióját hozza létre. Az energiatranszfer mértékét az ún. BRET-hányadossal jellemezhetjük. A BRET-vizsgálatok elvégzéséhez speciálisan nagy érzékenységű, Berthold gyártmányú Mithras multilabel leolvasót használunk. Membrán mikrodoméneket jelző sárga fluoreszcens fehérjével (YFP) jelölt bioszenzorokat készítettünk, melyekkel BRET-jelet válthatunk ki, ha a renilla luciferázzal jelölt receptor megjelenik a kompartmentben. E módszerrel kimutattuk, hogy AngII hatására az AT1-R eloszlása a sejtmembrán fénymikroszkóppal nem látható mikrodoménjei között megváltozik: az aktivált receptor előbb áthelyeződik nem-raft mikrodoménekbe, majd internalizációs kompartmentekbe kerül. Az AT1-R konzervált DRY (Asp-Arg-Tyr) szekvenciájának AAY (Ala-Ala-Tyr) szekvenciára cserélése olyan receptort eredményez, mely nem képes G-fehérjét aktiválni. E mutáns AT1-R segítségével HEK293-sejtekben kimutattuk, hogy a G-fehérje-aktiválás szükséges a receptor különböző mikrodomének közötti mozgásának kialakulásához (Balla et al., 2011). Azt is megfigyeltük, hogy a receptor internalizációja hamarabb jön létre, ha a receptor stimulálása G-fehérje-független módon történik, illetve a receptor nem jelenik meg a nem-raft mikrodoménben G-fehérje kötésére képtelen AT1-R stimulusát követően (Balla et al., 2012). Részletesen jellemeztük a receptor mozgásának és internalizációjának kinetikai eltéréseit az AT1-R G-fehérjét aktiváló (AngII) vagy G-fehérjétől független

aktivációt eredményező agonisták ([Sar1, Ile4, Ile8]-AngII) használatával is. Kimutattuk, hogy az AngII hatásával ellentétben [Sar1, Ile4, Ile8]-AngII agonista hatására a receptor nem jelenik meg a nem-raft mikrodoménben a receptor internalizációját megelőzően HEK293-sejtekben (Balla et al, 2012). E vizsgálatok alátámasztják, hogy a receptorok bizonyos mutációi, illetve egyes agonisták képesek a receptor jelátviteli folyamatainak szelektív aktiválására.

Betegséget okozó mutáció azonosítása
a V2-receptorban

A Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika munkatársaival (Dr. Patócs Attila, Dr. Tóth Miklós, Prof. Dr. Rácz Károly) együttműködve azonosítottunk egy nefrogén diabétesz inszipidusz betegben előforduló missense mutációt a V2-R génjében. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy a betegben azonosított mutáció a receptor mely funkcióját károsítja; a továbbiakban olyan V2-R ligandokat próbálunk azonosítani, amelyek a receptor jelátviteli folyamatait szelektíven aktiválják, és amelyek emiatt pozitívan befolyásolják a mutáns receptor működését. Első lépésben vizsgáltuk a mutáns receptor működését, mert nem állt rendelkezésre irodalmi adat arról, hogy e rendkívül ritka mutáció milyen mechanizmussal okoz funkcióvesztést. A méréseink során élősejtes kísérletekben vizsgáltuk a mutációt tartalmazó receptor tulajdonságait, és összevetettük őket a normális (eredeti) V2-receptor tulajdonságaival.

Kísérleteink elvégzése céljából olyan tesztrendszereket fejlesztettünk ki, melyek alkalmasak lehetnek nagyszámú vizsgálat (HTS) elvégzésére is. Erre alkalmas a nagy érzékenységű, 96-lyukú lemezeken, élő sejtekben is elvégezhető BRET-módszer. A V2-R olyan GFKR, mely Gs típusú heterotrimer G-fehérjét képes aktiválni. A különböző Gs-fehérje kapcsolt receptorok a fiziológiás agonista kötését követően elsősorban a Gs heterotrimer G-fehérje által közvetített jelátviteli útvonalakat aktiválnak, és adenilát-cikláz aktiválásán keresztül cAMP-függő jelátviteli folyamatok indulnak el. Kimutatták, hogy ezen típusú receptorok más jelátviteli útvonalakat is aktiválhatnak, melyek közül fontosnak tűnik a β-arresztin-kötés és a MAP-kináz (mitogén-aktivált protein-kináz) kaszkád elindítása emlős sejtekben. Megvizsgáltuk a mutáns receptor tulajdonságait, és összevetettük az eredeti receptoréval. Konfokális mikroszkópos eredmények alapján kimutattuk, hogy a mutáns receptor megtalálható a sejtmembránban, és a receptorszám az eredeti receptoréval összevethető nagyságrendű. További kísérleteinkben a sejten belüli cAMP-szint mérését végeztük el, mivel a V2-R-agonista kötése ezt a másodlagos hírvivő képzését indítja el. A HTS-vizsgálatok kivitelezhetőségét szem előtt tartva, alkalmazhatunk olyan rezonancia energiatranszferen alapú bioszenzorokat, amelyek segítségével élősejtes kísérletekben nyomon követhetjük a receptor aktiválódását. A cAMP a szabályozó hatását fehérjékhez kapcsolódva fejti ki, ilyen fehérje az EPAC (Exchange Protein directly Activated by cAMP), amely kis G-fehérjék működését befolyásolja. Az EPAC-fehérje cAMP-kötését követően konformációváltozáson megy keresztül, megteremtve a cAMP szenzorként való alkalmazásának lehetőségét. Az irodalomban már leírtak egy EPAC-alapú cAMP-szondát, amelynek működése fluoreszcencia rezonancia energiatranszferen (FRET) alapult (Ponsioen et al, 2004). A FRET-módszer hátránya a magas jel/zaj arány, valamint korlátozott alkalmazhatósága nagy elemszámú méréseknél, így szükségessé vált egy érzékenyebb módszer kidolgozása. Molekuláris biológiai módszerekkel biolumineszcens luciferáz fehérjét építettünk a bioszenzorba, amely már BRET-alapú, nagy érzékenységű, valós idejű mérések kivitelezését tett lehetővé (1. ábra, A). Ezen új bioszenzor felhasználásával megvizsgáltuk a mutációt tartalmazó V2-R cAMP jelátvitelét HEK293-sejtekben. Vazopresszin hatására a vad típusú receptordózis-függő cAMP válaszát detektáltuk, de a mutáns receptor fiziológiás hormonszint-tartományban nem hozott létre cAMP-szint emelkedést (1 ábra, B). Mivel a vazopresszin V1-receptoron keresztüli érszűkítő (és vérnyomásemelő) hatást hozhat létre, ezért a terápiában dezmopresszint alkalmaznak, mely egy V2R-szelektív vazopresszin analóg. Kísérleteinkben a dezmopresszin még nagy dózisban alkalmazva sem volt képes aktiválni a mutáns receptort.

A mutáció hatása a receptor jelátvitelére

További kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy a különböző Gs-kapcsolt receptorok létrehozzák-e a sejtproliferáció, sejtnövekedés és számos egyéb transzkripciós szintű szabályozásában központi szerepet játszó Ras-aktiválódást, illetve az ennek következtében létrejövő Ras- kis G-fehérje-aktiválódását. Gs-kapcsolt β2 adrenerg receptort (β2-R), az MC melanokortin receptort (MC4-R), az 5HT-7A szerotonin receptort (5HT7A-R) és a V2 receptorokat expresszáltunk HEK293-sejtekben, és megmértük a cAMP-jelet, a MAPK-foszforilációt és a Ras-aktiválódást (Balla et al., 2011). A sejtek endogén receptorainak feltérképezésére receptorral nem transzfektált sejteket is használtunk. Forskolin használatával, ami a cAMP képzéséért felelős enzimet közvetlenül aktiválja, a receptorok agonista kötése nélkül válthattunk ki cAMP-jelet, és az így kapott adatokat összevetettük a receptorokkal kapott adatokkal. Eredményeink szerint a V2-R a Ras által kiváltott jelpályán keresztül, míg a forskolin ingerlés, illetve a β2-R-, az MC4-R- és az 5HT7A-R-hormon kötése Ras-független útvonalon vált ki MAPK aktiválódást. Az általunk azonosított, betegséget okozó mutációt tartalmazó V2 receptort alkalmazva viszont nem kaptunk Ras-jelpálya aktiválódást, ami alátámasztja, hogy a receptor mutációja következtében a jelátviteli folyamat károsodott. Előzetes kísérleteink arra utalnak, hogy nagy dózisú vazopresszin képes aktiválni az általunk vizsgált mutáns receptort, ezért további kísérleteink célja olyan receptor agonisták azonosítása, melyek képesek e mutáns receptor aktiválására.

Összefoglalás

Kísérleteinkben kimutattuk, hogy az általunk használt megközelítési módok alkalmasak GFKR-ok aktivációjának és szelektív jelátvitelének tanulmányozására, valamint segítséget nyújthatnak a betegséget okozó receptormutációk jobb megértéséhez. Vizsgálataink azonosítottak egy betegséget okozó V2-R-mutációt. További kísérleteinkben olyan peptid- és nem-peptid vazopresszin receptor ligandokat próbálunk azonosítani, amelyek az általunk meghatározott, károsodott receptor mutáns működését kedvezően befolyásolják. Az általunk beállított BRET-technikán alapuló tesztrendszerek alkalmasak nagyszámú minta analízisére, így van esély arra, hogy vegyületkönyvtárak felhasználásával olyan molekulákat találjunk, melyek a mutáns V2-R működését kedvezően befolyásolják.
A nefrogén diabétesz inszipidusz betegséget számos más mutáció létrehozhatja, így az alkalmas terápiás megoldásnak a mutációtól függően egyénre szabottnak kell lennie. Ebben segíthet a különböző, betegséget okozó receptor mutációk működésének megértése és olyan gyógyszerjelöltek azonosítása, melyek az adott receptormutációt hordozó betegeken segíthetnek.
 

Kulcsszavak: G-fehérje kapcsolt receptorok, vazopresszin receptor, biolumineszcencia energiatranszfer (BRET), szelektív jelátvitel, személyre szabott terápia

IRODALOM

Balla A. – Erdélyi L. S. – Soltész-Katona E. – Balla T. – Várnai P. – Hunyady L. (2011): Demonstration of Angiotensin II-Induced Ras Activation in the Trans-Golgi Network and Endoplasmic Reticulum Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer-Based Biosensors. The Journal of Biological Chemistry. 286, 5319–5327.

Balla A. – Tóth D. – Soltész-Katona E. – Szakadáti G. – Erdélyi L. S. – Várnai P. – Hunyady L. (2012): Mapping of the Localization of Type I Angiotensin Receptor in Membrane Microdomains Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer-Based Sensors. The Journal of Biological Chemistry. 287, 9090–9099.

Ferguson, S. S. (2001): Evolving Concepts in G Protein-Coupled Receptor Endocytosis: The Role in Receptor Desensitization and Signaling. Pharmacological Reviews. 53, 1–24.

Hunyady L. – Catt, K. J. (2006): Pleiotropic AT1 Receptor Signaling Pathways Mediating Physiological and Pathogenic Actions of Angiotensin II. Molecular Endocrinology. 20, 5, 953–970.

Jean-Alphonse, F. – Perkovska, S. – Frantz, M. C. – Durroux, T. – Mejean, C. – Morin, D. – Loison, S. – Bonnet, D. – Hibert, M. – Mouillac, B. – Mendre, C. (2009): Biased Agonist Pharmacochaperones of the AVP V2 Receptor May Treat Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus. Journal of the American Society of Nephrology. 20, 2190–2203.

Kenakin, T. – Miller, L. J. (2010): Seven Transmembrane Receptors As Shapeshifting Proteins: the Impact of Allosteric Modulation and Functional Selectivity on New Drug Discovery. Pharmacological Reviews 62, 265–304.

Kenakin, T. (2011): Functional Selectivity and Biased Receptor Signaling. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 336, 296–302.

Ma, P. – Zemmel, R. (2002): Value of Novelty? Nature Reviews 1, 571–572.

Ponsioen, B. – Zhao, J. – Riedl, J. – Zwartkruis, F. – Van Der Krogt, G. – Zaccolo, M. – Moolenaar, W. H. – Bos, J. L. – Jalink, K. (2004): Detecting cAMP-Induced Epac Activation by Fluorescence Resonance Energy Transfer: Epac as a Novel cAMP Indicator. EMBO Reports. 5, 12,1176–1180.

Rajagopal, S. – Rajagopal, K. – Lefkowitz, R. J. (2010): Teaching Old Receptors New Tricks: Biasing Seven-Transmembrane Receptors. Nature Reviews. 9, 373–386.

Spanakis, E. – Milord, E. – Gragnoli, C. (2008): AVPR2 Variants and Mutations in Nephrogenic Diabetes Insipidus: Review and Missense Mutation Significance. Journal of Cellular Physiology. 217, 605–617.

Szidonya L. – Süpeki K. – Karip, E. – Turu, G. – Várnai P. – Clark, A. J. – Hunyady L. (2007): AT1 Receptor Blocker-Insensitive Mutant AT1A Angiotensin Receptors Reveal the Presence of G Protein-Independent Signaling in C9 Cells. Biochemical Pharmacology. 73, 10,1582–1592.

Wei, H. – Ahn, S. – Shenoy, S. K. – Karnik, S. S. – Hunyady L. – Luttrell, L. M. – Lefkowitz, R. J. (2003): Independent Beta-Arrestin 2 and G Protein-Mediated Pathways for Angiotensin II Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 and 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 10782–87.