Régen tudjuk, hogy a molekuláris folyamatok hátterében atomi és molekuláris mozgások vannak, azonban a mai napig nem sikerült kísérletileg demonstrálni ezek közvetlen funkcionális jelentőségét.

Több mint hat évvel ezelőtt, Lányi Szabolccsal, a Sapientia Egyetem csíkszeredai kampuszának dékánjával beszélgettem, és azon morfondíroztunk, hogy nem lehetne-e egy enzim működését befolyásolni azáltal, hogy az atomjait specifikusan rezgetjük rádió vagy THz frekvenciájú elektromágneses hullámokkal. A kísérletek tervezése után hat év megfeszített munkába került, mire sikerült olyan kísérleti rendszert összeállítani, amellyel – tudomásunk szerint – a világon elsőként sikerült atomi vibrációk megváltoztatása révén enzimreakciót kiváltanunk. A világon egyetlen olyan szabadelektron lézerközpont van, a drezdai Helmholtz Centrum, ahol megfelelő frekvencián olyan hatalmas energiát tudtunk bejuttatni a fehérjébe igen rövid idő alatt, amely hatékony módon specifikus vibrációs változásokat hoz létre. Éveket vett igénybe, amíg ebben a központban felépítettük a különleges műszeregyüttest. Budapestről kisteherautóval szállítottuk az eszközöket Drezdába, ahol a speciális műszereket összeépítettük a szabadelektron lézerrel. Ugyanakkor évekig tartott, amíg számtalan próbálkozás eredményeként sikerült olyan enzimet előállítanunk, amely a kísérlethez megfelelt. A siker nem jöhetett volna létre, ha a munkát nem interdiszciplináris csapat végzi, amelyben molekuláris biológus, fizikus, mérnök, lézerfizikus és enzimológus is van: Rauscher Anna, Lőrincz István, Schay Gusztáv, Michael Gensch és Málnási-Csizmadia András. Óriási élmény ilyen hosszú, kitartó munka révén egy régi tudományos problémát felderíteni.

…és miért jó ez? Úgy gondoljuk, meggyőző, direkt bizonyítékot sikerült szolgáltatnunk arra vonatkozólag, hogy a molekuláris rezgések közvetlenül meghatározzák az enzimfunkciót. Eddig például a gyógyszer- és enzimtervezést szinte kizárólag a molekulák atomi szerkezetére alapozva végezték. Eredményeink megnyithatják a kaput az új alapokon álló molekulatervezéshez, amelyben az atomi vibrációkat és mozgásokat közvetlen módon is figyelembe veszik.

Büszkék vagyunk, hogy a European Research Council (ERC) tizenegy másik mellett ezt a projektet választotta, hogy az ERC által kiadott ötezredik pályázat jubileuma alkalmából bemutassa az európai tudomány értékeit.

Az alábbiakban ízelítőt szeretnénk adni kísérleteinkből.

A kutatók régi álma, hogy megfejtsék az enzimek működését, hiszen minél jobban értjük, hogyan működnek, annál célzottabban tudjuk a működésüket gyógyszerekkel befolyásolni, annál hatékonyabban tudjuk gyógyítani a működésük hibáiból fakadó betegségeket. Ha pontosabban megismernénk a működésük alapjait, jobban tudnánk tőlük tanulni is, vagy másolni őket. Így hatékonyabban tudnánk felhasználni őket a szervezetünkön kívül, mesterséges körülmények között gyógyszerek előállítására, szennyezések eltávolítására, diagnosztikai eszközök, érzékelők tervezésére.

Az enzimek működésének megismeréséhez először a szerkezetük megfejtésére van szükség. Az ötvenes években sikerült először röntgendiffrakció segítségével kristályosított fehérjék szerkezetét megfejteni, így láthatóvá vált az enzimek belső felépítése egy-egy pillanatképen. Később különböző állapotú enzimek pillanatképének összehasonlításakor kiderült, hogy az enzimek működése közben ez a szerkezet változik. Az is láthatóvá vált, hogy a gyógyszerek hova kötődnek az enzimeken. Azóta a röntgentechnikák olyan magas szintűre fejlődtek, hogy SAXS (small angle X-ray scattering) segítségével képesek vagyunk „lefilmezni” az enzimeket, és jól látszik, hogy minden enzim a saját feladatára specializált jellegzetes mozgást végez működése közben.

Vajon mi hajtja ezeket a mozgásokat? Vannak-e rugók, racsnik, kapcsolók az enzimekben? Hogyan derítsük ki, mi romlott el abban a nem működő enzimben, amelynek látszólag sértetlen a szerkezete? Mi az oka, hogy egyes gyógyszerek ránézésre egyformán kötődnek ugyanahhoz az enzimhez, mégis ellentétes hatást váltanak ki? Hogyan tudnak ránézésre egyforma, rokon enzimek egész különböző feladatokat ellátni a sejtekben? Erre a röntgendiffrakciós felvételek közvetlenül nem adnak választ.

A röntgendiffrakciós felvételek alapján az enzimek szerkezetéről pillanatképet tudunk készíteni akár nagyon nagy felbontásban is. Ekkor a több tízezer atomból álló fehérje minden egyes atomjának pontos helye látszik. Ha ismert egy ilyen nagy pontosságú szerkezet, onnantól az atomok közötti vonzások, kölcsönhatások és az ezek hatására történő elmozdulások a fizika törvényeinek segítségével kiszámíthatók. Így számítógépen modellezhető, szimulálható az enzimek működése, mozgása, és számítógépes kísérletek is folytathatók. A molekuláris dinamikai szimulációk során kiderült, hogy a nagyobb amplitúdójú, röntgendiffrakciós felvételeken is látható mozgások mellett az enzimek atomjai folyamatos rezgésben vannak, és az aminosav oldalláncok, valamint a fehérjelánc gerince is jellegzetes vibrációs mintázattal rendelkezik. Érdekes korrelációk is megfigyelhetők ezekben a kis amplitúdójú rezgésekben, ami arra utalhat, hogy akár távoli, egymással közvetlenül nem érintkező atomcsoportok érzékelhetik egymás állapotát. Azt már régóta sejtjük, hogy ezeknek a molekuláris rezgéseknek lehet szerepük az enzimek működésében. Hogyan lehetne ezeket a rezgéseket kísérletekkel vizsgálni, a jelentőségüket, szerepüket kideríteni?

Az anyagok színe arról tudósít, hogy milyen hullámhosszú fényt nyelnek el a molekulák elektronjai, ha látható fénnyel világítjuk meg őket. A fehérjék, az enzimeink legtöbbször színtelenek vagy fehérek. Ha viszont infravörös sugárzással világítjuk meg őket, akkor az elnyelésük a frekvencia függvényében egy infravörös mintázatot ad, amelynek az egyedi fehérjékre jellemző szakaszát infravörös ujjlenyomatnak szokás nevezni. Ez az ujjlenyomat a molekuláris rezgéseket jellemzi, így az infravörös spektroszkópia segítségével az enzimek működése közben vizsgálható a fehérjén belüli rezgések dinamikája. Az utóbbi években kiderült, hogy a nagy, egész enzimre kiterjedő mozgásokhoz hasonlóan ezek a kis amplitúdójú rezgések is

összehangoltan követik az enzimek működési lépéseit. Vajon mi lehet a szerepük? A kis amplitúdójú mozgások, molekuláris rezgések következményei vagy okozói a nagy szerkezetváltozásoknak, az enzimműködésnek?

Számítógépes szimulációs kísérletben teszteltük, hogy ha a molekuláris rezgések frekvenciáját megcélozva egy infravörös impulzussal besugarazunk egy enzimet, akkor átrendeződnek a rezgések, és ennek következtében megváltozik az enzim szerkezete. Vajon létre tudunk-e hozni kísérletesen ilyen jelenséget valódi fehérjékben? Lehetséges-e kívülről közvetlenül szerkezeti változást kiváltani azáltal, hogy bizonyos rezgéseket vagy térbeli rezgési mintázatokat közvetlenül módosítunk? Ha sikerülne, az közvetlenül bizonyítaná, hogy a szerkezet mellett a rezgési mintázatok is kulcsfontosságúak, és ezek együtt határozzák meg a fehérjeszerkezeti átalakulásokat, vagyis az enzimműködést. Annyira a műszereink érzékenységének a határán van egy ilyen jelenség vizsgálata, hogy ezekre a kérdésekre előttünk a világon még senkinek nem sikerült válaszolnia. Nekünk is évekbe telt, mire áttörést értünk el, és sikerült a világon először a rezgéseket kívülről gerjesztve megváltoztatni a fehérje szerkezetét.

Két dolgot tartva szem előtt építettünk egy saját mérőkészüléket. Egyrészt, legyen minél több esélyünk arra, hogy ezt a nehezen előidézhető és nehezen észrevehető folyamatot előidézhessük és jellemezhessük. Másrészt, a kísérleti körülményeket igyekeztünk minél természetesebbnek megőrizni, hogy a kísérleti enzimünk minél inkább egy élő sejt belsejéhez hasonló közegben legyen. Fontos volt, hogy az enzimeinket érő viszonylag magas infravörös háttérsugárzásnál nagyságrendekkel nagyobb sugárzást tudjunk a mintánkra fókuszálni, ezért Európa legerősebb infralézer berendezését választottuk helyszínül, hogy biztosra menjünk a rezgések gerjesztésekor. A rezgések gerjesztéséhez olyan különleges lézert használtunk, amely nagyon rövid pillanatokig – a másodperc billiárdod részéig (pikoszekundumig) – a Nap felszíni energiájának tizenötezerszeresét bocsátja ki infravörös sugárzás formájában. Európában csak egyetlen intézetben, a drezdai Helmholtz Centrumban van ilyen lézer, ott végeztük a kísérleteket. Ezen kívül három kihívást kellett megoldanunk. Egyrészt az enzimek természetes közege a vizes közeg, de a víz nagyon hatékonyan nyeli el az infravörös sugarakat, ezért tized/század milliméter vastagságúra kellett vékonyítanunk a mintatartót, hogy az infravörös sugarakat elnyelő vízréteg elég vékony maradjon, és mindenhova biztosan eljusson az infravörös besugárzás. Másrészt mivel hatalmas besugárzási energiát közöltünk a mintával, speciális hűtést kellett alkalmaznunk, hogy szobahőmérsékleten tudjunk minden kísérletet végezni. Harmadrészt, olyan enzimet kellett választanunk, amelynek a mozgása, szerkezete röntgenberendezés nélkül is könnyen és azonnal látható. Ahogy korábban már írtuk, a fehérjék, enzimek többnyire fehérek vagy átlátszók. De van néhány színes kivétel, a fluoreszkáló fehérjék, melyeknek a fluoreszcenciája nagyon érzékeny a fehérjegombolyag szerkezetének változásaira, és ez minden pillanatban könnyen mérhető jelzést ad az aktuális állapotukról. Mi egy narancsszínű fehérjét választottuk (LSS-mOrange), amely ráadásul annyira stabil, hogy a sejten kívül, kísérleti körülmények között is napokig megőrzi natív formáját.

Mit tapasztaltunk a kísérlet során? Az infravörös besugárzás megnövelte a narancs színű fehérjénk fluoreszcenciáját, ezzel jelezve, hogy a fehérje szerkezete megváltozott. Az új szerkezet csak a besugárzás ideje alatt volt stabil, a besugárzás megszüntetésekor a szerkezet visszaalakult, melyet a fluoreszcencia csökkenése jelzett. Ismételt besugárzásra ismét kialakult a módosult szerkezet, amely bizonyítja, hogy a fehérje mindvégig funkcionált, nem egy természetellenes, visszafordíthatatlan folyamatot indítottunk el a rezgések gerjesztésével. Ezzel az áttöréssel a fenti számítógépes kísérletünket a valóságban igazoltuk, bebizonyítottuk, hogy az infravörös frekvenciákra rezonáló molekuláris rezgések a fehérjében képesek nagyléptékű szerkezetváltozást előidézni, így meghatározó szerepük lehet az enzimek mozgatásában, működtetésében.

A felfedezett jelenség különlegessége, hogy az infravörös besugárzás frekvenciájától függ a szerkezetváltozás hatékonysága, így valószínűsíthető, hogy a molekuláris rezgéseknek speciális szerepük van ebben a szerkezetváltozásban. Szkeptikusok mondhatnák, hogy az infravörös sugarak melegítő hatása régóta ismert, és a melegedéstől mozgó enzim egyáltalán nem újdonság. Ellenőriztük azonban, hogy irányított infravörös besugárzás nélkül, kizárólag melegítéssel nem váltható ki ez a jellegzetes szerkezetváltozás, ami a fluoreszcencia emelkedésével jár.

Kijelenthetjük tehát, hogy a molekuláris rezgések befolyásolásával sikerült közvetlenül beavatkoznunk egy fehérje mozgásába, működésébe. Valószínűsíthető, hogy ezeknek a rezgéseknek alapvető szerepük van abban, hogy hatékonyan működnek az enzimek. Szerepük lehet például abban, hogy közvetítenek az enzim távoli pontjai között, illetve ezeknek a rezgéseknek a mintázatában lehet különbség, amikor látszólag egyforma szerkezetű enzimek vagy gyógyszerek eltérően viselkednek. Felfedezésünk új irányokat nyithat az enzimek vizsgálatában. A rezgések tanulmányozásával és figyelembevételükkel jobb gyógyszerek és hatékonyabb mesterséges enzimek fejleszthetők.

A kutatásainkat az egzotikus fluoreszcens fehérjék mellett a jövőben első lépésben kiterjesztjük az emberi szervezetben kulcsfontosságú membránfehérjékre és ioncsatornákra. Ezek a fehérjék szabályozzák a sejt és a külvilág összeköttetését, kulcsszerepük van a sejtek közötti kommunikációban és idegi ingerületátvitelben. Mivel kísérletünkben az infravörös besugárzásra kialakuló elektromos térerő változások hasonlítanak a szervezetünk sejtjeit határoló membránokban kialakuló elektromos térerő változásokhoz, így közelebb kerülhetünk annak megértéséhez, hogy a sejteink életében mi a szerepük a most felfedezett, enzimeket működtető molekuláris rezgéseknek.
 

Kulcsszavak: fehérjedinamika, enzimműködés, molekuláris rezgések, infravörös spektroszkópia, konformációváltozás